Cellulær membran affinitet kromatografi kolonner for å identifisere spesialiserte plante metabolitter samhandler med immobilisert tropomyosin kinase reseptor B

Summary

Protokollen beskriver fremstillingen av cellemembran affinitet kromatografi (CMAC) kolonner med immobiliserte cellemembranfragmenter som inneholder funksjonelle transmembrane tropomyosin kinase reseptor B-proteiner. Bruken av CMAC-kolonner i identifisering av spesialiserte plantemetabolitter som samhandler med disse reseptorene og tilstede i komplekse naturlige blandinger, forklares også.

Abstract

Kjemikalier syntetisert av planter, sopp, bakterier og marine hvirvelløse dyr har vært en rik kilde til nye narkotika treff og fører. Legemidler som statiner, penicillin, paclitaxel, rapamycin eller artemisinin, som vanligvis brukes i medisinsk praksis, har først blitt identifisert og isolert fra naturlige produkter. Imidlertid er identifisering og isolasjon av biologisk aktive spesialiserte metabolitter fra naturlige kilder en utfordrende og tidkrevende prosess. Tradisjonelt er individuelle metabolitter isolert og renset fra komplekse blandinger, etter utvinning av biomasse. Deretter testes de isolerte molekylene i funksjonelle analyser for å verifisere deres biologiske aktivitet. Her presenterer vi bruken av cellulære membranaffinitetskromatografi (CMAC) kolonner for å identifisere biologisk aktive forbindelser direkte fra komplekse blandinger. CMAC-kolonner tillater identifisering av forbindelser som samhandler med immobiliserte funksjonelle transmembranproteiner (TMPer) innebygd i deres opprinnelige fosfolipid bilayermiljø. Dette er en målrettet tilnærming, som krever å kjenne TMP hvis aktivitet man har til hensikt å modulere med den nylig identifiserte lille molekylmedisinkandidaten. I denne protokollen presenterer vi en tilnærming for å forberede CMAC-kolonner med immobilisert tropomyosin kinase reseptor B (TrkB), som har dukket opp som et levedyktig mål for narkotikaoppdagelse for mange nervesystemforstyrrelser. I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll for å montere CMAC-kolonnen med immobiliserte TrkB-reseptorer ved hjelp av nevroblastomcellelinjer som overekspresserer TrkB-reseptorer. Vi presenterer videre tilnærmingen til å undersøke funksjonaliteten til kolonnen og dens bruk i identifisering av spesialiserte plantemetabolitter som samhandler med TrkB-reseptorer.

Introduction

Botaniske blandinger er rike på farmakologisk aktive forbindelser¹, og tjener som en god kilde for identifisering av nye legemiddeltreff og fører ^2,3,4,5. Oppdagelsen av nye medisiner fra naturlige produkter har vært en fruktbar tilnærming, og mange for tiden godkjente legemidler stammer fra forbindelser som først ble identifisert i naturen. Det kjemiske mangfoldet av naturlige forbindelser er vanskelig å bli matchet av menneskeskapte biblioteker av kjemisk syntetiserte molekyler. Mange naturlige forbindelser samhandler med og modulerer menneskelige proteinmål og kan betraktes som evolusjonært optimaliserte legemiddellignende molekyler⁶. Disse naturlige forbindelsene er spesielt godt egnet for legemiddelledningsidentifikasjon til bruk i nevrologiske lidelser⁶. To av de for tiden FDA-godkjente legemidlene for håndtering av Alzheimers sykdom (AD) er avledet fra naturlige alkaloider, nemlig: galantamin og rivastigmin (et derivat av physostigmine)⁶. L-DOPA, for tiden det mest foreskrevne stoffet for Parkinsons sykdom, ble først identifisert fra den brede bønnen (Vicia faba L.) ⁷. Pergolide og lisurid, dopaminerge reseptoragonister er derivater av naturlige ergot alkaloider fra den parasittiske soppen Claviceps purpurea⁸. Reserpin, en alkaloid isolert fra indisk snakeroot (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) var en av de første antipsykotika⁹. Nylig har dysregulert immunrespons og systemisk betennelse vært knyttet til utviklingen av mange nevrologiske plager, for eksempel stor depressiv lidelse eller nevrodegenerative sykdommer¹⁰. Et plantebasert kosthold sammen med andre livsstilsintervensjoner har vist seg å forbedre kognitive og funksjonelle evner hos eldre 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Visse elektrofile molekyler som tilhører triterpener og polyfenoler har vist seg å modulere inflammatoriske responser i både in vitro– og in vivo-modeller ¹². For eksempel naturlige forbindelser som inneholder α,β-umettet karbonyl (f.eks. curcumin, cinnamaldehyd) eller isothiocyanatgruppe (f.eks. sulforaphane) forstyrrer tolllignende reseptor-4 (TLR4) dimerisering som hemmer nedstrøms syntesen av proinflammatoriske cytokiner i en murin interleukin-3 avhengig pro-B cellelinje^12,22 . Epidemiologiske bevis peker sterkt på at kostholdsfytokjemikalier, tilstede i komplekse matmatriser, også kan utgjøre en levedyktig kilde til nye legemiddelledninger⁶.

En av de største hindringene for identifisering av biologisk aktive molekyler tilstede i planteekstrakter, inkludert plantebasert mat, er kompleksiteten til de undersøkte prøvene. Tradisjonelt er de enkelte forbindelsene isolert, renset og deretter testet for biologisk aktivitet. Denne tilnærmingen fører vanligvis til identifisering av de mest tallrike og godt karakteriserte forbindelsene. Fenotypisk legemiddeloppdagelse nærmer seg uten et definert molekylært mål, avhengig av biostyrt fraksjonering av komplekse blandinger²³. I denne tilnærmingen er et ekstrakt fraksjonert i mindre komplekse underfraksjoner som senere testes i fenotypiske analyser. Isolering og rensing av aktive forbindelser styres av biologisk aktivitet verifisert i analysen. Kunnskapen om identiteten til et bestemt legemiddelmål kan øke hastigheten på identifiseringen av farmakologisk aktive forbindelser som finnes i komplekse blandinger. Disse tilnærmingene er vanligvis basert på immobilisering av det molekylære målet, for eksempel et enzym, på en solid overflate, som magnetiske perler²³. De immobiliserte målene brukes deretter i screeningforsøkene, noe som resulterer i isolering av forbindelser som samhandler med målet. Selv om denne tilnærmingen har blitt mye brukt i identifisering av forbindelser rettet mot cytosoliske proteiner, har den blitt mindre vanlig brukt i identifisering av kjemikalier som samhandler med transmembranproteiner (TMPer)²³. En ekstra utfordring i immobiliseringen av TMPer stammer fra det faktum at proteinets aktivitet avhenger av samspillet med cellemembranfolipider og andre molekyler i bilayeren som kolesterol^23,24. Det er viktig å bevare disse subtile interaksjonene mellom proteiner og deres innfødte fosfolipid bilayermiljø når de prøver å immobilisere transmembranmålet.

I cellulær membran affinitet kromatografi (CMAC) cellemembran fragmenter, og ikke renset proteiner, er immobilisert på kunstig membran (IAM) stasjonære fase partikler²³. IAM stasjonære faser fremstilles ved å binde fosfatidylkolinanaloger kovalent på silika. Nylig er det utviklet nye klasser av IAM stasjonære faser der gratis amin- og silanolgrupper er end-capped (IAM. Pc. DD2 partikler). Under CMAC kolonner forberedelse cellemembran fragmenter er immobilisert på overflaten av IAM partikler gjennom adsorpsjon.

CMAC-kolonner har blitt brukt til å immobilisere forskjellige klasser av TMPer, inkludert ionkanaler (f.eks. nikotinreseptorer), GPCR-er (f.eks. opioidreseptorer), proteintransportører (f.eks. p-glykoprotein), ^etc.24. De immobiliserte proteinmålene har blitt brukt i karakteriseringen av farmakodynamikk (f.eks. dissosiasjonskonstant, Kd) eller å bestemme bindende kinetikk (k_på og k_off) av små molekylligander som samhandler med målet, samt i prosessen med identifisering av potensielle nye legemiddelledninger tilstede i komplekse matriser²⁴ . Her presenterer vi utarbeidelsen av CMAC-kolonner med den immobiliserte tropomyosin kinase reseptoren B (TrkB), som har dukket opp som et levedyktig mål for narkotikaoppdagelse for mange nervesystemforstyrrelser.

Tidligere studier viste at aktiveringen av den hjerneavledede nevrotrofiske faktoren (BDNF)/TrkB-banen er forbundet med forbedring av visse nevrologiske plager, som AD eller stor depressiv lidelse 25,26,27,28. Det ble rapportert at BDNF nivåer og dens reseptor TrkB uttrykk nedgang i AD, og lignende reduksjoner svekke hippocampal funksjon i dyremodeller av^{29 e.Kr}. Reduserte nivåer av BDNF ble rapportert i serum og hjerne hos AD-pasienter 30,31,32. Tau overekspressjon eller hyperfosforylering ble funnet å nedregulere BDNF-uttrykk i primære nevroner og AD-dyremodeller 33,34,35. I tillegg ble BDNF rapportert å ha beskyttende effekter på β-amyloid indusert nevrotoksisitet in vitro og in vivo³⁶. Direkte BDNF-administrasjon i rottehjernen ble vist å øke læring og hukommelse hos kognitivt svekkede dyr³⁷. BDNF/TrkB fremstod som et gyldig mål for å forbedre nevrologiske og psykiatriske lidelser, inkludert^{28,38 e.Kr}. Å målrette BDNF/TrkB-signalveien for utvikling av terapier i AD vil potensielt forbedre vår forståelse av sykdommen³⁹. Dessverre kan BDNF selv ikke brukes som behandling på grunn av sine dårlige farmakokinetiske egenskaper og bivirkninger⁴⁰. Små molekylaktivatorer av TrkB/BDNF-veier har blitt utforsket som potensielle TrkB-ligander 41,42,43. Blant testede små molekylagonister har 7,8-dihydroksyflavon (7,8-DHF), vist seg å aktivere BDNF /TrkB-banen 41,44,45,46. Et derivat på 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenyl-4H-krom-7,8-diyl bis (metylkarbamat)) er for tiden under vurdering som et mulig legemiddel for⁴⁷ e.Kr. Nylig ble det vist at flere antidepressiva jobber gjennom direkte binding til TrkB og fremme BDNF-signalering, og understreker ytterligere viktigheten av å forfølge TrkB som et gyldig mål for å behandle ulike nevrologiske lidelser⁴⁸.

Protokollen beskriver prosessen med å sette sammen funksjonell TrkB-kolonne og TrkB-NULL negativ kontrollkolonne. Kolonnene er preget av et kjent naturlig produkt småmolekylær ligand: 7,8-DHF. I tillegg beskriver vi prosessen med å screene komplekse matriser, ved hjelp av planteekstrakt som eksempel, for identifisering av forbindelser som samhandler med TrkB.

Protocol

1. Cellekultur av SH-SY5Y nevroblastomceller (TrkB og TrkB-NULL (foreldre) cellelinjer) MERK: Cellelinjer (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) og SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 ble kjøpt fra Kerafast. Kultiverte celler brukes som en kilde til transmembranreseptorene som skal immobiliseres for fremstilling av CMAC-kolonner. Trinnene nedenfor beskriver hvordan du får tak i cellemembranfragmenter og monterer funks…

Representative Results

Etter protokollen ble to CMAC kromatografiske kolonner montert: en med de immobiliserte SH-SY5Y nevroblastomcellemembranfragmentene med overekspressert TrkB og en med SH-SY5Y TrkB-NULL cellemembranfragmenter. Den korrekt monterte CMAC-kolonnen presenteres i figur 1 , og trinnene som er involvert i immobilisering av cellemembranfragment, presenteres i figur 2. Siden immobilisering av TrkB reseptorer på IAM. Pc. DD2 kromatografisk stas…

Discussion

Identifisering av aktive forbindelser tilstede i komplekse blandinger av spesialiserte metabolitter er en svært utfordrende oppgave²³. Tradisjonelt er individuelle forbindelser isolert, og deres aktivitet testes i forskjellige analyser. Denne tilnærmingen er tidkrevende og kostbar og fører ofte til isolasjon og identifisering av de mest tallrike og godt karakteriserte forbindelsene²³. For tiden brukes screeninganalyser med høy gjennomstrømning og er avhengige av scree…

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon Plan Fluor	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA