Cellulära membranaffinitetskromatografikolonner för att identifiera specialiserade växtmetaboliter som interagerar med immobiliserad tromboyosinkinasreceptor B

Summary

Protokollet beskriver beredningen av cellmembranaffinitetskromatografikolonner (CMAC) med immobiliserade cellmembranfragment innehållande funktionella transmembrantropomyosinkinasreceptor B-proteiner. Användningen av CMAC-kolumner vid identifiering av specialiserade växtmetaboliter som interagerar med dessa receptorer och närvarande i komplexa naturliga blandningar förklaras också.

Abstract

Kemikalier som syntetiseras av växter, svampar, bakterier och marina ryggradslösa djur har varit en rik källa till nya läkemedelsträffar och ledningar. Läkemedel såsom statiner, penicillin, paklitaxel, rapamycin, eller artemisinin, vanligen används i medicinsk praxis, har först identifierats och isolerats från naturliga produkter. Identifiering och isolering av biologiskt aktiva specialiserade metaboliter från naturliga källor är dock en utmanande och tidskrävande process. Traditionellt isoleras och renas enskilda metaboliter från komplexa blandningar efter extraktion av biomassa. Därefter testas de isolerade molekylerna i funktionella analyser för att verifiera deras biologiska aktivitet. Här presenterar vi användningen av cellulära membranaffinitetskromatografikolonner (CMAC) för att identifiera biologiskt aktiva föreningar direkt från komplexa blandningar. CMAC-kolumner möjliggör identifiering av föreningar som interagerar med immobiliserade funktionella transmembranproteiner (TMP) inbäddade i deras ursprungliga fosfolipid-dubbelskiktsmiljö. Detta är ett målinriktat tillvägagångssätt, vilket kräver att man känner till TMP vars aktivitet man avser att modulera med den nyligen identifierade småmolekylära läkemedelskandidaten. I detta protokoll presenterar vi ett tillvägagångssätt för att förbereda CMAC-kolumner med immobiliserad tropomyosinkinasreceptor B (TrkB), som har framstått som ett livskraftigt mål för läkemedelsupptäckt för många nervsystemet. I den här artikeln tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att montera CMAC-kolonnen med immobiliserade TrkB-receptorer med hjälp av neuroblastomcellinjer som överuttrycker TrkB-receptorer. Vi presenterar vidare tillvägagångssättet för att undersöka kolonnens funktionalitet och dess användning vid identifiering av specialiserade växtmetaboliter som interagerar med TrkB-receptorer.

Introduction

Botaniska blandningar är rika på farmakologiskt aktiva föreningar¹, som fungerar som en bra källa för identifiering av nya läkemedelsträffar och leder 2,3,4,5. Upptäckten av nya läkemedel från naturprodukter har varit ett fruktbart tillvägagångssätt och många för närvarande godkända läkemedel härstammar från föreningar som först identifierades i naturen. Den kemiska mångfalden av naturliga föreningar är svår att matcha av konstgjorda bibliotek av kemiskt syntetiserade molekyler. Många naturliga föreningar interagerar med och modulerar mänskliga proteinmål och kan betraktas som evolutionärt optimerade läkemedelsliknande molekyler⁶. Dessa naturliga föreningar är särskilt väl lämpade för läkemedelsledaridentifiering för användning vid neurologiska störningar⁶. Två av de för närvarande FDA-godkända läkemedlen för hantering av Alzheimers sjukdom (AD) härrör från naturliga alkaloider, nämligen: galantamin och rivastigmin (ett derivat av fysostigmin)⁶. L-DOPA, för närvarande det vanligaste förskrivna läkemedlet för Parkinsons sjukdom, identifierades först från den breda bönan (Vicia faba L.) ⁷. Pergolid och lisurid, dopaminerga receptoragonister är derivat av naturliga ergotalkaloider från parasitsvampen Claviceps purpurea⁸. Reserpin, en alkaloid isolerad från indisk ormrot (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz) var ett av de första antipsykotiska läkemedlen⁹. Nyligen har dysreglerat immunsvar och systemisk inflammation kopplats till utvecklingen av många neurologiska sjukdomar, såsom egentlig depression eller neurodegenerativa sjukdomar¹⁰. En växtbaserad kost tillsammans med andra livsstilsinterventioner har visat sig förbättra kognitiva och funktionella förmågor hos äldre 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21 . Vissa elektrofila molekyler som tillhör triterpener och polyfenoler har visat sig modulera inflammatoriska svar i både in vitro– och in vivo-modeller ¹². Till exempel stör naturliga föreningar som innehåller α,β-omättad karbonyl (t.ex. curcumin, kanelaldehyd) eller isotiocyanatgrupp (t.ex. sulforafan) Toll-liknande receptor-4 (TLR4) dimerisering som hämmar nedströmssyntesen av proinflammatoriska cytokiner i en murin interleukin-3 beroende pro-B-cellinje^12,22 . Epidemiologiska bevis pekar starkt på att fytokemikalier i kosten, som finns i komplexa livsmedelsmatriser, också kan utgöra en livskraftig källa till nya läkemedelsledningar⁶.

Ett av de största hindren för identifiering av biologiskt aktiva molekyler som finns i växtextrakt, inklusive växtbaserad mat, är komplexiteten hos de undersökta proverna. Traditionellt isoleras, renas de enskilda föreningarna och testas därefter för biologisk aktivitet. Detta tillvägagångssätt leder vanligtvis till identifiering av de mest rikliga och väl karakteriserade föreningarna. Fenotypiska läkemedelsupptäcktsmetoder utan ett definierat molekylärt mål förlitar sig på biostyrd fraktionering av komplexa blandningar²³. I detta tillvägagångssätt fraktioneras ett extrakt i mindre komplexa delfraktioner som därefter testas i fenotypiska analyser. Isoleringen och reningen av aktiva föreningar styrs av biologisk aktivitet verifierad i analysen. Kunskapen om identiteten hos ett specificerat läkemedelsmål kan avsevärt påskynda identifieringen av farmakologiskt aktiva föreningar som finns i komplexa blandningar. Dessa tillvägagångssätt är vanligtvis baserade på immobilisering av det molekylära målet, till exempel ett enzym, på en fast yta, som magnetiska pärlor²³. De immobiliserade målen används därefter i screeningexperimenten vilket resulterar i isolering av föreningar som interagerar med målet. Även om detta tillvägagångssätt har använts i stor utsträckning vid identifiering av föreningar som riktar sig mot cytosoliska proteiner, har det varit mindre vanligt vid identifiering av kemikalier som interagerar med transmembranproteiner (TMP)²³. En ytterligare utmaning i immobiliseringen av TMP härrör från det faktum att proteinets aktivitet beror på dess interaktion med cellmembranfosfolipider och andra molekyler i dubbelskiktet, såsom kolesterol^23,24. Det är viktigt att bevara dessa subtila interaktioner mellan proteiner och deras inhemska fosfolipid dubbelskiktsmiljö när man försöker immobilisera transmembranmålet.

I cellulär membranaffinitetskromatografi (CMAC) är cellmembranfragment, och inte renade proteiner, immobiliserade på det artificiella membranet (IAM) stationära faspartiklar²³. IAM stationära faser framställs genom kovalent bindning av fosfatidylkolinanaloger på kiseldioxid. Nyligen har nya klasser av IAM stationära faser utvecklats där fria amin- och silanolgrupper är sluttäckta (IAM. Persondator. DD2-partiklar). Under CMAC-kolonner förbereds cellmembranfragment på ytan av IAM-partiklar genom adsorption.

CMAC-kolumner har hittills använts för att immobilisera olika klasser av TMP inklusive jonkanaler (t.ex. nikotinreceptorer), GPCR (t.ex. opioidreceptorer), proteintransportörer (t.ex. p-glykoprotein), ^etc.24. De immobiliserade proteinmålen har använts vid karakterisering av farmakodynamik (t.ex. dissociationskonstant, Kd) eller bestämning av bindningskinetik (k_på och k_av) av småmolekylära ligander som interagerar med målet samt i processen att identifiera potentiella nya läkemedelsledningar som finns i komplexa matriser²⁴ . Här presenterar vi beredningen av CMAC-kolumner med den immobiliserade tropomyosinkinasreceptorn B (TrkB), som har framstått som ett livskraftigt mål för läkemedelsupptäckt för många nervsystemet.

Tidigare studier visade att aktiveringen av den hjärnhärledda neurotrofiska faktorn (BDNF) / TrkB-vägen är associerad med förbättring av vissa neurologiska sjukdomar, såsom AD eller egentlig depression 25,26,27,28. Det rapporterades att BDNF-nivåerna och dess receptor TrkB-uttryck minskar i AD, och liknande minskningar försämrar hippocampusfunktionen i djurmodeller av AD²⁹. Minskade nivåer av BDNF rapporterades i serum och hjärna hos AD-patienter 30,31,32. Tau-överuttryck eller hyperfosforylering visade sig nedreglera BDNF-uttryck i primära neuroner och AD-djurmodeller 33,34,35. Dessutom rapporterades BDNF ha skyddande effekter på β-amyloidinducerad neurotoxicitet in vitro och in vivo³⁶. Direkt administrering av BDNF i råtthjärnan visade sig öka inlärning och minne hos kognitivt nedsatta djur³⁷. BDNF/TrkB framstod som ett giltigt mål för att förbättra neurologiska och psykiatriska störningar inklusive AD ^28,38. Att rikta in sig på BDNF/ TrkB-signalvägen för utveckling av terapier i AD kommer potentiellt att öka vår förståelse av sjukdomen³⁹. Tyvärr kan BDNF i sig inte användas som behandling på grund av dess dåliga farmakokinetiska egenskaper och negativa biverkningar⁴⁰. Småmolekylaktivatorer av TrkB/ BDNF-vägar har undersökts som potentiella TrkB-ligander 41,42,43. Bland testade småmolekylära agonister har 7,8-dihydroxiflavon (7,8-DHF) visat sig aktivera BDNF/TrkB-vägen 41,44,45,46. Ett derivat av 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-fenyl-4H-kromen-7,8-diyl bis(metylkarbamat)) övervägs för närvarande som ett möjligt läkemedel för AD⁴⁷. Nyligen visades det att flera antidepressiva medel fungerar genom direkt bindning till TrkB och främjande av BDNF-signalering, vilket ytterligare betonar vikten av att driva TrkB som ett giltigt mål för att behandla olika neurologiska störningar⁴⁸.

Protokollet beskriver processen för montering av funktionell TrkB-kolumn och TrkB-NULL negativ kontrollkolonn. Kolonnerna karakteriseras med användning av en känd naturlig produkt småmolekylär ligand: 7,8-DHF. Dessutom beskriver vi processen för screening av komplexa matriser, med hjälp av växtextrakt som ett exempel, för identifiering av föreningar som interagerar med TrkB.

Protocol

1. Cellodling av SH-SY5Y neuroblastomceller (TrkB och TrkB-NULL (föräldra) cellinjer) OBS: Cellinjer (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) och SH-SY5Y Parental Cell Line (TrkB NULL))49,50 köptes från Kerafast. Odlade celler används som en källa till transmembranreceptorerna som ska immobiliseras för framställning av CMAC-kolumner. Följande steg beskriver hur man får cellmembranfragment och monterar funktionella CMAC-k…

Representative Results

Efter protokollet monterades två CMAC-kromatografiska kolumner: en med de immobiliserade SH-SY5Y-neuroblastomcellmembranfragmenten med överuttryckt TrkB och en med SH-SY5Y TrkB-NULL-cellmembranfragment. Den korrekt monterade CMAC-kolonnen presenteras i figur 1 och stegen som är involverade i immobilisering av cellmembranfragment presenteras i figur 2. Sedan immobiliseringen av TrkB-receptorer på IAM. Persondator. DD2-kromatografis…

Discussion

Identifiering av aktiva föreningar som finns i komplexa blandningar av specialiserade metaboliter är en mycket utmanande uppgift²³. Traditionellt isoleras enskilda föreningar och deras aktivitet testas i olika analyser. Detta tillvägagångssätt är tidskrävande och kostsamt och leder ofta till isolering och identifiering av de vanligaste och väl karakteriserade föreningarna²³. Screeninganalyser som för närvarande används med hög kapacitet är starkt beroende av…

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon Plan Fluor	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA