عزل الخلايا البطانية الشبكية للجيل التالي
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا البطانية الشبكية بعد الولادة للفئران المحسنة لإنتاجية الخلايا ونقاوتها وقابليتها للحياة. هذه الخلايا مناسبة لنهج تسلسل الجيل التالي.
Abstract
أدت التحسينات الأخيرة في تسلسل الجيل التالي إلى تطوير معرفة الباحثين بالبيولوجيا الجزيئية والخلوية ، مع العديد من الدراسات التي كشفت عن نماذج جديدة في بيولوجيا الأوعية الدموية. يتطلب تطبيق هذه الأساليب على نماذج تطور الأوعية الدموية تحسين تقنيات عزل الخلايا من الأنسجة الجنينية وما بعد الولادة. يجب أن يكون كل من إنتاجية الخلية وقابليتها للحياة والنقاء الأقصى للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار من مناهج التسلسل من الجيل التالي. يستخدم الباحثون نموذج الأوعية الدموية لشبكية العين للفأر الوليدي لدراسة آليات تطور الأوعية الدموية. استخدم الباحثون هذا النموذج للتحقيق في آليات تكوين الأوعية الدموية وتحديد مصير الشرايين الوريدية أثناء تكوين الأوعية الدموية ونضجها. يتطلب تطبيق تقنيات تسلسل الجيل التالي لدراسة نموذج تطور الأوعية الدموية في شبكية العين تحسين طريقة لعزل الخلايا البطانية الشبكية التي تزيد من إنتاجية الخلايا وصلاحيتها ونقاوتها. يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل أنسجة شبكية الفئران والهضم والتنقية باستخدام فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS). تشير النتائج إلى أن مجموعة الخلايا البطانية CD31 + / CD45 المنقاة ب FACS غنية للغاية للتعبير الجيني للخلايا البطانية ولا تظهر أي تغيير في الصلاحية لمدة 60 دقيقة بعد FACS. وشملت النتائج التمثيلية لنهج تسلسل الجيل التالي على الخلايا البطانية المعزولة باستخدام هذه الطريقة، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي الريبي السائب وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية، مما يدل على أن هذه الطريقة لعزل الخلايا البطانية في شبكية العين متوافقة مع تطبيقات تسلسل الجيل التالي. ستسمح هذه الطريقة لعزل الخلايا البطانية في شبكية العين بتقنيات تسلسل متقدمة للكشف عن آليات جديدة لتطور الأوعية الدموية.
Introduction
إن القدرة الإنتاجية العالية لتسلسل الأحماض النووية عبر مناهج التسلسل من الجيل التالي قد عززت بشكل كبير معرفة الباحثين بالبيولوجيا الجزيئية والخلوية. تشمل هذه التقنيات المتقدمة تسلسل الحمض النووي الريبي للنسخ الكامل ، وتسلسل الحمض النووي للمناطق المستهدفة لتحديد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) ، وتسلسل الحمض النووي لعوامل النسخ المرتبطة في تسلسل الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) ، أو مناطق الكروماتين المفتوحة في الفحص لتسلسل الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه بواسطة Transposase (ATAC) ، وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية1 . في بيولوجيا الأوعية الدموية ، سمحت هذه التطورات للباحثين بتوضيح الآليات المعقدة للتطور والمرض ، إلى جانب تمييز أنماط التعبير الجيني على طول سلسلة متصلة من الأنماط الظاهرية المختلفة 2,3. يمكن للتجارب المستقبلية تحديد الآليات المعقدة بشكل أكبر من خلال الجمع بين تسلسل الجيل التالي والنماذج المقيمة لتطور الأوعية الدموية ، ولكن يجب أن تكون طرق تحضير العينات متوافقة مع تقنيات التسلسل المتقدمة.
تعتمد جودة ودقة وقابلية استنساخ مناهج التسلسل من الجيل التالي على طريقة تحضير العينة. عند عزل مجموعة فرعية من الخلايا أو توليد معلقات أحادية الخلية من الأنسجة ، فإن طرق الهضم والتنقية المثلى ضرورية لزيادة عدد الخلايا وصلاحيتها ونقاوتها 4,5. يتطلب ذلك توازنا في طريقة الهضم: الهضم القوي ضروري لتحرير الخلايا من الأنسجة والحصول على خلايا كافية لنهج المصب ، لكن صلاحية الخلية ستتأثر سلبا إذا كان الهضم قويا جدا 6,7. بالإضافة إلى ذلك ، يعد نقاء عدد الخلايا ضروريا للحصول على نتائج قوية وتحليل دقيق للبيانات ، والتي يمكن تحقيقها من خلال FACS. هذا يسلط الضوء على أهمية تحسين طرق عزل الخلايا لتطبيق تسلسل الجيل التالي على النماذج الراسخة لتطور الأوعية الدموية.
نموذج مميز جيدا للتحقيق في تطور الأوعية الدموية هو نموذج تطوير الأوعية الدموية في شبكية العين. يتطور الأوعية الدموية الشبكية للفأر بعد الولادة في ضفيرة سطحية ثنائية الأبعاد ، مع ظهور نشوء وعائي أولي من العصب البصري في يوم ما بعد الولادة (P) 3 ، وجبهة وعائية مع خلايا ساق وطرف ونضوج أولي للأوعية مرئية عند P6 ، ونضوج الضفيرة الوعائية مرئية بعد P9 8,9. أثناء إعادة تشكيل الضفيرة الوعائية الأولية ، تخضع الخلايا البطانية لمواصفات نحو الأنماط الظاهرية الشريانية والشعيرية والوريدية في أوعية مختلفة لتوليد شبكة الدورة الدموية10,11. لذلك ، تسمح هذه الطريقة للباحثين بتصور تكوين الضفيرة الوعائية الوعائية والمواصفات البطانية الشريانية الوريدية والنضج في نقاط زمنية مختلفة أثناء التطور9. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا النموذج طريقة للتحقيق في آثار التلاعب المعدل وراثيا على تكوين الأوعية الدموية وتطور الضفيرة الوعائية ، والتي تم تطبيقها للتحقيق في تطور الأوعية الدموية ، والتشوهات الشريانية الوريدية ، والأوعية الدموية الجديدة التي يسببها الأكسجين12،13،14،15،16 . من أجل الجمع بين نهج تسلسل الجيل التالي مع نموذج تطوير الأوعية الدموية في شبكية العين ، من الضروري وجود بروتوكول محسن لعزل الخلايا البطانية من أنسجة الشبكية.
يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة لهضم أنسجة الشبكية من الفئران في P6 لزيادة إنتاجية الخلايا ونقاوتها وقابليتها للحياة. يتم عزل أنسجة الشبكية من الفئران P6 ، ويتم هضمها لمدة 20 دقيقة ، وصبغها المناعي ل CD31 و CD45 ، وتنقيتها من خلال FACS لعزل تعليق خلية واحدة من الخلايا البطانية في حوالي 2.5 ساعة (الشكل 1 أ). تم العثور على هذه الخلايا البطانية للحفاظ على قابلية عالية للحياة لمدة 60 دقيقة بعد العزل17 ، مما يسمح للمكتبة الاستعدادات لطرق تسلسل الجيل التالي. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير نتائج تمثيلية لبوابة FACS ونتائج مراقبة الجودة من طريقتين منفصلتين لتسلسل الجيل التالي باستخدام بروتوكول العزل هذا: تسلسل الحمض النووي الريبي الكامل للنسخ وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية. تسمح هذه الطريقة باستخدام مناهج تسلسل الجيل التالي جنبا إلى جنب مع نموذج الأوعية الدموية في شبكية العين لتوضيح آليات جديدة لتطور الأوعية الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا البطانية من أنسجة شبكية الفئران بعد الولادة والتي تم تحسينها للحصول على عدد خلايا مرتفع ونقاوة وقابلية للحياة. يتم الحصول على نقاء الخلية عن طريق عزل FACS لمجموعات الخلايا البطانية من معلق الخلية الواحدة المهضوم بواسطة CD31 + / CD45- التلوين المناعي. يتم قيا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكرا لمرفق قياس التدفق الخلوي بجامعة ييل ، والمرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي بجامعة فيرجينيا ، ومركز ييل للتحليل الجينومي ، وجامعة فيرجينيا لتحليل الجينوم والتكنولوجيا الأساسية على جهودهم وخبراتهم ونصائحهم في المساهمة في التجارب المقدمة. تم تمويل هذه الدراسة من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة إلى N.W.C. (T32 HL007224 ، T32 HL007284) ، SC (T32 HL007284) ، KW (R01 HL142650) ، و K.K.H. (R01 HL146056 ، R01 DK118728 ، UH3 EB025765).
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
References
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D’Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
