Isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração
Summary
Este protocolo descreve um método para o isolamento de células endoteliais da retina pós-natais murinas otimizado para o rendimento, pureza e viabilidade celular. Essas células são adequadas para abordagens de sequenciamento de próxima geração.
Abstract
Melhorias recentes no sequenciamento de próxima geração avançaram o conhecimento dos pesquisadores sobre biologia molecular e celular, com vários estudos revelando novos paradigmas em biologia vascular. A aplicação desses métodos a modelos de desenvolvimento vascular requer a otimização de técnicas de isolamento celular de tecidos embrionários e pós-natais. O rendimento, a viabilidade e a pureza das células precisam ser máximos para obter resultados precisos e reprodutíveis das abordagens de sequenciamento de próxima geração. O modelo de vascularização da retina de camundongos neonatais é usado por pesquisadores para estudar mecanismos de desenvolvimento vascular. Os pesquisadores usaram esse modelo para investigar mecanismos de angiogênese e especificação do destino arterial-venoso durante a formação e maturação dos vasos sanguíneos. A aplicação de técnicas de sequenciamento de próxima geração para estudar o modelo de desenvolvimento vascular da retina requer a otimização de um método para o isolamento de células endoteliais da retina que maximize o rendimento, a viabilidade e a pureza celular. Este protocolo descreve um método para isolamento, digestão e purificação do tecido retiniano murino usando a classificação celular ativada por fluorescência (FACS). Os resultados indicam que a população de células endoteliais CD31+/CD45- purificadas por CACS é altamente enriquecida para a expressão gênica de células endoteliais e não apresenta alteração na viabilidade por 60 min pós-CASC. Estão incluídos resultados representativos de abordagens de sequenciamento de próxima geração em células endoteliais isoladas usando este método, incluindo sequenciamento de RNA em massa e sequenciamento de RNA de célula única, demonstrando que este método para isolamento de células endoteliais da retina é compatível com aplicações de sequenciamento de próxima geração. Este método de isolamento das células endoteliais da retina permitirá técnicas avançadas de sequenciamento para revelar novos mecanismos de desenvolvimento vascular.
Introduction
A capacidade de alto rendimento do sequenciamento de ácidos nucleicos por meio de abordagens de sequenciamento de próxima geração avançou muito o conhecimento dos pesquisadores sobre biologia molecular e celular. Essas técnicas avançadas incluem sequenciamento de RNA de transcriptoma inteiro, sequenciamento de DNA de regiões-alvo para identificar polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), sequenciamento de DNA de fatores de transcrição ligados no sequenciamento de imunoprecipitação de cromatina (ChIP) ou regiões de cromatina abertas em ensaio para sequenciamento de cromatina acessível à transposase (ATAC) e sequenciamento de RNA de célula única1 . Na biologia vascular, esses avanços permitiram aos pesquisadores elucidar mecanismos complicados de desenvolvimento e doença, além de distinguir padrões de expressão gênica ao longo de um continuum de fenótipos variados 2,3. Experimentos futuros podem definir ainda mais mecanismos complexos, combinando o sequenciamento de próxima geração com modelos avaliados de desenvolvimento vascular, mas os métodos de preparação de amostras precisam ser compatíveis com as técnicas avançadas de sequenciamento.
A qualidade, precisão e reprodutibilidade das abordagens de sequenciamento de próxima geração dependem do método de preparação da amostra. Ao isolar um subconjunto de células ou gerar suspensões unicelulares a partir de tecidos, métodos ideais de digestão e purificação são essenciais para maximizar o número celular, a viabilidade e a pureza da população celular 4,5. Isso requer um equilíbrio no método de digestão: uma digestão forte é necessária para liberar células do tecido e obter células suficientes para abordagens a jusante, mas a viabilidade celular será afetada negativamente se a digestão for muito forte 6,7. Além disso, a pureza da população celular é necessária para resultados robustos e análise precisa dos dados, o que pode ser realizado através do FACS. Isso destaca a importância de otimizar os métodos de isolamento celular para aplicar o sequenciamento de próxima geração a modelos estabelecidos de desenvolvimento vascular.
Um modelo bem caracterizado para investigar o desenvolvimento vascular é o modelo de desenvolvimento vascular da retina murina. A vasculatura retiniana murina desenvolve-se no pós-natal em um plexo superficial bidimensional, com brotação angiogênica inicial do nervo óptico visível no dia pós-natal (P)3, frente angiogênica com células do caule e da ponta e maturação inicial dos vasos visível em P6, e maturação do plexo vascular visível após P9 8,9. Durante o remodelamento do plexo vascular inicial, as células endoteliais passam por especificação para fenótipos arteriais, capilares e venosos em diferentes vasos para gerar uma rede circulatória10,11. Portanto, esse método permite aos pesquisadores visualizar a formação do plexo vascular angiogênico e a especificação e maturação arterial-venosa endotelial em vários momentos durante o desenvolvimento9. Além disso, esse modelo fornece um método para investigar os efeitos da manipulação transgênica sobre a angiogênese e o desenvolvimento do plexo vascular, que tem sido aplicado para a investigação do desenvolvimento vascular, malformações arteriais-venosas e neovascularização induzida por oxigênio 12,13,14,15,16 . A fim de combinar abordagens de sequenciamento de próxima geração com o modelo de desenvolvimento vascular da retina murina, é necessário um protocolo otimizado para o isolamento de células endoteliais do tecido da retina.
Este protocolo descreve um método otimizado para digerir o tecido da retina de camundongos em P6 para maximizar o rendimento celular, a pureza e a viabilidade. O tecido da retina é isolado de camundongos P6, digerido por 20 min, imunocorado para CD31 e CD45 e purificado através de FACS para isolar uma única suspensão celular de células endoteliais em cerca de 2,5 h (Figura 1A). Verificou-se que essas células endoteliais mantêm alta viabilidade por 60 minutos após o isolamento17, permitindo preparações de biblioteca para métodos de sequenciamento de próxima geração. Além disso, resultados representativos são fornecidos para o controle de qualidade e os resultados do controle de qualidade do FACS de dois métodos separados de sequenciamento de próxima geração usando esse protocolo de isolamento: sequenciamento de RNA de transcriptoma inteiro e sequenciamento de RNA de célula única. Este método permite que abordagens de sequenciamento de próxima geração sejam usadas em conjunto com o modelo de vascularização da retina para elucidar novos mecanismos de desenvolvimento vascular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método para o isolamento de células endoteliais do tecido retiniano murino pós-natal que foi otimizado para alto número de células, pureza e viabilidade. A pureza celular é obtida pelo isolamento FACS de populações de células endoteliais da suspensão unicelular digerida por imunocoloração CD31+/CD45-. A qualidade do isolamento é quantificada em ensaios de viabilidade pela coloração azul de tripano e expressão gênica por qPCR para CD31, CD45 e VE-Caderina (embora a VE-Caderrina …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Obrigado ao Yale Flow Cytometry Facility, ao University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, ao Yale Center for Genomic Analysis e ao University of Virginia Genome Analysis and Technology Core por seu esforço, experiência e aconselhamento em contribuir para os experimentos apresentados. Este estudo foi financiado por subsídios do NIH para N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) e K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
References
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D’Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
