Isolatie van murine retinale endotheelcellen voor next-generation sequencing
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van muriene postnatale retinale endotheelcellen die zijn geoptimaliseerd voor celopbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid. Deze cellen zijn geschikt voor next-generation sequencing benaderingen.
Abstract
Recente verbeteringen in de sequencing van de volgende generatie hebben de kennis van onderzoekers over moleculaire en cellulaire biologie verbeterd, met verschillende studies die nieuwe paradigma’s in de vasculaire biologie onthullen. Het toepassen van deze methoden op modellen van vasculaire ontwikkeling vereist de optimalisatie van celisolatietechnieken uit embryonale en postnatale weefsels. Celopbrengst, levensvatbaarheid en zuiverheid moeten allemaal maximaal zijn om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te verkrijgen van de volgende generatie sequencingbenaderingen. Het neonatale retinale vascularisatiemodel van de muis wordt door onderzoekers gebruikt om mechanismen van vasculaire ontwikkeling te bestuderen. Onderzoekers hebben dit model gebruikt om mechanismen van angiogenese en arteriaal-veneuze lotspecificatie tijdens bloedvatvorming en rijping te onderzoeken. Het toepassen van sequencingtechnieken van de volgende generatie om het retinale vasculaire ontwikkelingsmodel te bestuderen, vereist optimalisatie van een methode voor de isolatie van retinale endotheelcellen die de celopbrengst, levensvatbaarheid en zuiverheid maximaliseert. Dit protocol beschrijft een methode voor murine retinale weefselisolatie, spijsvertering en zuivering met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). De resultaten geven aan dat de FACS-gezuiverde CD31+/CD45-endotheelcelpopulatie sterk verrijkt is voor endotheelcelgenexpressie en gedurende 60 minuten na FACS geen verandering in levensvatbaarheid vertoont. Inbegrepen zijn representatieve resultaten van next-generation sequencing benaderingen op endotheelcellen geïsoleerd met behulp van deze methode, inclusief bulk RNA sequencing en single-cell RNA sequencing, wat aantoont dat deze methode voor retinale endotheelcelisolatie compatibel is met next-generation sequencing toepassingen. Deze methode van retinale endotheelcelisolatie zal geavanceerde sequencingtechnieken mogelijk maken om nieuwe mechanismen van vasculaire ontwikkeling te onthullen.
Introduction
De hoge doorvoercapaciteit van het sequentiëren van nucleïnezuren via next-generation sequencing-benaderingen heeft de kennis van onderzoekers over moleculaire en cellulaire biologie enorm verbeterd. Deze geavanceerde technieken omvatten whole transcriptome RNA sequencing, DNA sequencing van doelgebieden om Single Nucleotide Polymorphisms (SNP’s) te identificeren, DNA sequencing van gebonden transcriptiefactoren in Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) sequencing, of open chromatine regio’s in Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) sequencing, en single-cell RNA sequencing1 . In de vasculaire biologie hebben deze ontwikkelingen onderzoekers in staat gesteld om gecompliceerde mechanismen van ontwikkeling en ziekte op te helderen, samen met onderscheidende genexpressiepatronen langs een continuüm van verschillende fenotypen 2,3. Toekomstige experimenten kunnen complexe mechanismen verder definiëren door de volgende generatie sequencing te combineren met geëvalueerde modellen van vasculaire ontwikkeling, maar de methoden voor monstervoorbereiding moeten compatibel zijn met de geavanceerde sequencingtechnieken.
De kwaliteit, nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de volgende generatie sequencingbenaderingen zijn afhankelijk van de methode van monstervoorbereiding. Bij het isoleren van een subset van cellen of het genereren van eencellige suspensies uit weefsels, zijn optimale verterings- en zuiveringsmethoden essentieel voor het maximaliseren van het celaantal, de levensvatbaarheid en de zuiverheid van de celpopulatie 4,5. Dit vereist een balans in de verteringsmethode: een sterke spijsvertering is nodig om cellen uit het weefsel vrij te maken en voldoende cellen te verkrijgen voor stroomafwaartse benaderingen, maar de levensvatbaarheid van cellen zal negatief worden beïnvloed als de spijsvertering te sterk is 6,7. Bovendien is zuiverheid van de celpopulatie noodzakelijk voor robuuste resultaten en nauwkeurige analyse van gegevens, die kunnen worden bereikt via FACS. Dit benadrukt het belang van het optimaliseren van celisolatiemethoden om next-generation sequencing toe te passen op gevestigde modellen van vasculaire ontwikkeling.
Een goed gekarakteriseerd model voor het onderzoeken van vasculaire ontwikkeling is het murine retinale vasculaire ontwikkelingsmodel. Murine retinale vasculatuur ontwikkelt zich postnataal in een tweedimensionale oppervlakkige plexus, met initiële angiogene kieming uit de oogzenuw zichtbaar op postnatale dag (P)3, angiogene front met stengel- en tipcellen en initiële vaatrijping zichtbaar bij P6, en rijping van de vasculaire plexus zichtbaar na P9 8,9. Tijdens de remodellering van de initiële vasculaire plexus ondergaan endotheelcellen specificatie voor arteriële, capillaire en veneuze fenotypen in verschillende vaten om een bloedsomloopnetwerk te genereren 10,11. Daarom stelt deze methode onderzoekers in staat om angiogene vasculaire plexusvorming en endotheel arteriële-veneuze specificatie en rijping op verschillende tijdstippen tijdens ontwikkeling9 te visualiseren. Daarnaast biedt dit model een methode voor het onderzoeken van de effecten van transgene manipulatie op angiogenese en vasculaire plexusontwikkeling, die is toegepast voor het onderzoek naar vasculaire ontwikkeling, arteriaal-veneuze malformaties en zuurstof-geïnduceerde neovascularisatie 12,13,14,15,16 . Om de volgende generatie sequencingbenaderingen te combineren met het murine retinale vasculaire ontwikkelingsmodel, is een geoptimaliseerd protocol voor de isolatie van endotheelcellen uit netvliesweefsel noodzakelijk.
Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode voor het verteren van netvliesweefsel van muizen op P6 om de celopbrengst, zuiverheid en levensvatbaarheid te maximaliseren. Retinaal weefsel wordt geïsoleerd uit P6-muizen, gedurende 20 minuten verteerd, immunostained voor CD31 en CD45 en gezuiverd door FACS om een eencellige suspensie van endotheelcellen in ongeveer 2,5 uur te isoleren (figuur 1A). Deze endotheelcellen bleken gedurende 60 minuten na isolatie17 een hoge levensvatbaarheid te behouden, waardoor bibliotheekvoorbereidingen voor sequencingmethoden van de volgende generatie mogelijk waren. Daarnaast worden representatieve resultaten verstrekt voor FACS gating en kwaliteitscontroleresultaten van twee afzonderlijke next-generation sequencingmethoden met behulp van dit isolatieprotocol: whole transcriptome RNA sequencing en single-cell RNA sequencing. Deze methode maakt het mogelijk om next-generation sequencingbenaderingen te gebruiken in combinatie met het retinale vascularisatiemodel om nieuwe mechanismen van vasculaire ontwikkeling op te helderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft een methode voor de isolatie van endotheelcellen uit postnatale murine retinale weefsel die is geoptimaliseerd voor een hoog celaantal, zuiverheid en levensvatbaarheid. Celzuiverheid wordt verkregen door FACS-isolatie van endotheelcelpopulaties uit de verteerde eencellige suspensie door CD31 +/CD45-immunostaining. Kwaliteit van isolatie wordt gekwantificeerd in testen op levensvatbaarheid door Trypan blauwe kleuring en genexpressie door qPCR voor CD31, CD45 en VE-Cadherine (hoewel VE-Cadherine nie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dank aan de Yale Flow Cytometry Facility, de University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, het Yale Center for Genomic Analysis en de University of Virginia Genome Analysis and Technology Core voor hun inspanningen, expertise en advies om bij te dragen aan de gepresenteerde experimenten. Deze studie werd gefinancierd door NIH-subsidies aan N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) en K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
References
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D’Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
