Isolering af murine retinale endotelceller til næste generations sekventering
Summary
Denne protokol beskriver en metode til isolering af murine postnatal retinale endotelceller optimeret til celleudbytte, renhed og levedygtighed. Disse celler er velegnede til næste generations sekventeringsmetoder.
Abstract
Nylige forbedringer i næste generations sekventering har avanceret forskernes viden om molekylær og cellulær biologi, hvor flere undersøgelser afslører nye paradigmer inden for vaskulær biologi. Anvendelse af disse metoder til modeller for vaskulær udvikling kræver optimering af celleisoleringsteknikker fra embryonale og postnatale væv. Celleudbytte, levedygtighed og renhed skal alle være maksimale for at opnå nøjagtige og reproducerbare resultater fra næste generations sekventeringsmetoder. Den neonatale mus retinale vaskulariseringsmodel bruges af forskere til at studere mekanismer for vaskulær udvikling. Forskere har brugt denne model til at undersøge mekanismer for angiogenese og arteriel-venøs skæbnespecifikation under dannelse og modning af blodkar. Anvendelse af næste generations sekventeringsteknikker til at studere den retinale vaskulære udviklingsmodel kræver optimering af en metode til isolering af retinale endotelceller, der maksimerer celleudbytte, levedygtighed og renhed. Denne protokol beskriver en metode til murine retinal vævsisolering, fordøjelse og oprensning ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Resultaterne indikerer, at den FACS-oprensede CD31 + / CD45- endotelcellepopulation er stærkt beriget til endotelcellegenekspression og udviser ingen ændring i levedygtighed i 60 minutter efter FACS. Inkluderet er repræsentative resultater af næste generations sekventeringsmetoder på endotelceller isoleret ved hjælp af denne metode, herunder bulk RNA-sekventering og enkeltcelle RNA-sekventering, hvilket viser, at denne metode til retinal endotelcelleisolering er kompatibel med næste generations sekventeringsapplikationer. Denne metode til retinal endotelcelleisolering vil give mulighed for avancerede sekventeringsteknikker til at afsløre nye mekanismer for vaskulær udvikling.
Introduction
Den høje kapacitetskapacitet af sekventering af nukleinsyrer via næste generations sekventeringsmetoder har i høj grad avanceret forskernes viden om molekylær og cellulær biologi. Disse avancerede teknikker omfatter hele transkriptom RNA-sekventering, DNA-sekventering af målrettede regioner til identifikation af enkeltnukleotidpolymorfier (SNP’er), DNA-sekventering af bundne transkriptionsfaktorer i kromatinimmunoprecipitation (ChIP) sekventering eller åbne kromatinregioner i Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) sekventering og enkeltcelle RNA-sekventering1 . I vaskulær biologi har disse fremskridt gjort det muligt for forskere at belyse komplicerede udviklings- og sygdomsmekanismer sammen med at skelne genekspressionsmønstre langs et kontinuum af forskellige fænotyper 2,3. Fremtidige eksperimenter kan yderligere definere komplekse mekanismer ved at kombinere næste generations sekventering med evaluerede modeller for vaskulær udvikling, men metoderne til prøveforberedelse skal være kompatible med de avancerede sekventeringsteknikker.
Kvaliteten, nøjagtigheden og reproducerbarheden af næste generations sekventeringsmetoder afhænger af metoden til prøveforberedelse. Ved isolering af en delmængde af celler eller generering af enkeltcellesuspensioner fra væv er optimale fordøjelses- og oprensningsmetoder afgørende for at maksimere celleantal, levedygtighed og renhed af cellepopulationen 4,5. Dette kræver en balance i fordøjelsesmetoden: stærk fordøjelse er nødvendig for at frigive celler fra vævet og opnå nok celler til nedstrøms tilgange, men cellelevedygtigheden vil blive negativt påvirket, hvis fordøjelsen er for stærk 6,7. Derudover er renheden af cellepopulationen nødvendig for robuste resultater og nøjagtig analyse af data, som kan opnås gennem FACS. Dette fremhæver vigtigheden af at optimere celleisoleringsmetoder til at anvende næste generations sekventering på etablerede modeller for vaskulær udvikling.
En velkarakteriseret model til undersøgelse af vaskulær udvikling er murine retinal vaskulær udviklingsmodel. Murine retinal vaskulatur udvikler sig postnatalt i en todimensionel overfladisk plexus, med indledende angiogen spiring fra synsnerven synlig ved postnatal dag (P)3, angiogen front med stilk- og spidsceller og indledende karmodning synlig ved P6 og modning af vaskulær plexus synlig efter P9 8,9. Under ombygningen af den indledende vaskulære plexus gennemgår endotelceller specifikation mod arterielle, kapillære og venøse fænotyper i forskellige kar for at generere et kredsløbsnetværk10,11. Derfor giver denne metode forskere mulighed for at visualisere angiogen vaskulær plexusdannelse og endotelarteriel-venøs specifikation og modning på forskellige tidspunkter under udvikling9. Derudover giver denne model en metode til at undersøge virkningerne af transgen manipulation på angiogenese og vaskulær plexusudvikling, som er blevet anvendt til undersøgelse af vaskulær udvikling, arterielle-venøse misdannelser og oxygeninduceret neovaskularisering 12,13,14,15,16 . For at kombinere næste generations sekventeringsmetoder med murine retinal vaskulær udviklingsmodel er en optimeret protokol til isolering af endotelceller fra retinalt væv nødvendig.
Denne protokol beskriver en optimeret metode til fordøjelse af retinalt væv fra mus ved P6 for at maksimere celleudbytte, renhed og levedygtighed. Retinalt væv isoleres fra P6-mus, fordøjes i 20 minutter, immunfarves til CD31 og CD45 og renses gennem FACS for at isolere en enkeltcellesuspension af endotelceller på ca. 2,5 timer (figur 1A). Disse endotelceller viste sig at opretholde høj levedygtighed i 60 minutter efter isolering17, hvilket gjorde det muligt at forberede biblioteket til næste generations sekventeringsmetoder. Derudover leveres repræsentative resultater for FACS-gating- og kvalitetskontrolresultater fra to separate næste generations sekventeringsmetoder ved hjælp af denne isolationsprotokol: hele transkriptom-RNA-sekventering og enkeltcellet RNA-sekventering. Denne metode gør det muligt at anvende næste generations sekventeringsmetoder sammen med den retinale vaskulariseringsmodel for at belyse nye mekanismer for vaskulær udvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til isolering af endotelceller fra postnatal murin retinal væv, der er optimeret til højt celleantal, renhed og levedygtighed. Cellerenhed opnås ved FACS-isolering af endotelcellepopulationer fra den fordøjede enkeltcellesuspension ved CD31+/CD45- immunostaining. Kvaliteten af isolering kvantificeres i assays for levedygtighed ved trypanblåfarvning og genekspression ved qPCR for CD31, CD45 og VE-Cadherin (selvom VE-Cadherin ikke blev anvendt til immunostaining). De kritiske trin i …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tak til Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis og University of Virginia Genome Analysis and Technology Core for deres indsats, ekspertise og rådgivning i at bidrage til de præsenterede eksperimenter. Denne undersøgelse blev finansieret af NIH-tilskud til N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) og K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
References
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D’Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
