Isolering av murina retinala endotelceller för nästa generations sekvensering
Summary
Detta protokoll beskriver en metod för isolering av murina postnatala retinala endotelceller optimerade för cellutbyte, renhet och livskraft. Dessa celler är lämpliga för nästa generations sekvenseringsmetoder.
Abstract
De senaste förbättringarna i nästa generations sekvensering har avancerat forskarnas kunskap om molekylär- och cellbiologi, med flera studier som avslöjar nya paradigmer inom vaskulär biologi. Att tillämpa dessa metoder på modeller av vaskulär utveckling kräver optimering av cellisoleringstekniker från embryonala och postnatala vävnader. Cellutbyte, viabilitet och renhet måste alla vara maximala för att få exakta och reproducerbara resultat från nästa generations sekvenseringsmetoder. Den neonatala musretinala vaskulariseringsmodellen används av forskare för att studera mekanismer för vaskulär utveckling. Forskare har använt denna modell för att undersöka mekanismer för angiogenes och arteriell-venös ödespecifikation under blodkärlsbildning och mognad. Att tillämpa nästa generations sekvenseringstekniker för att studera retinal vaskulär utvecklingsmodell kräver optimering av en metod för isolering av retinala endotelceller som maximerar cellutbyte, livskraft och renhet. Detta protokoll beskriver en metod för murin retinal vävnadsisolering, matsmältning och rening med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Resultaten indikerar att den FACS-renade CD31 + / CD45-endotelcellpopulationen är mycket berikad för endotelcellsgenuttryck och uppvisar ingen förändring i livskraft under 60 minuter efter FACS. Inkluderat är representativa resultat av nästa generations sekvenseringsmetoder på endotelceller isolerade med denna metod, inklusive bulk-RNA-sekvensering och encells RNA-sekvensering, vilket visar att denna metod för retinal endotelcellisolering är kompatibel med nästa generations sekvenseringsapplikationer. Denna metod för retinal endotelcellisolering möjliggör avancerade sekvenseringstekniker för att avslöja nya mekanismer för vaskulär utveckling.
Introduction
Den höga genomströmningskapaciteten för sekvensering av nukleinsyror via nästa generations sekvenseringsmetoder har i hög grad avancerat forskarnas kunskap om molekylär- och cellbiologi. Dessa avancerade tekniker inkluderar heltranskriptom RNA-sekvensering, DNA-sekvensering av riktade regioner för att identifiera Single Nucleotide Polymorphisms (SNP), DNA-sekvensering av bundna transkriptionsfaktorer i ChIP-sekvensering (ChIP) eller öppna kromatinregioner i analys för Transposas-Accessible Chromatin (ATAC) sekvensering och encells RNA-sekvensering1 . Inom vaskulärbiologi har dessa framsteg gjort det möjligt för forskare att belysa komplicerade mekanismer för utveckling och sjukdom, tillsammans med att särskilja genuttrycksmönster längs ett kontinuum av varierande fenotyper 2,3. Framtida experiment kan ytterligare definiera komplexa mekanismer genom att kombinera nästa generations sekvensering med utvärderade modeller för vaskulär utveckling, men metoderna för provberedning måste vara kompatibla med de avancerade sekvenseringsteknikerna.
Kvaliteten, noggrannheten och reproducerbarheten hos nästa generations sekvenseringsmetoder beror på metoden för provberedning. Vid isolering av en delmängd av celler eller generering av encellssuspensioner från vävnader är optimala matsmältnings- och reningsmetoder avgörande för att maximera cellantal, livskraft och renhet hos cellpopulationen 4,5. Detta kräver en balans i matsmältningsmetoden: stark matsmältning är nödvändig för att frigöra celler från vävnaden och få tillräckligt med celler för nedströms tillvägagångssätt, men cellviabiliteten kommer att påverkas negativt om matsmältningen är för stark 6,7. Dessutom är renhet hos cellpopulationen nödvändig för robusta resultat och korrekt analys av data, vilket kan uppnås genom FACS. Detta belyser vikten av att optimera cellisoleringsmetoder för att tillämpa nästa generations sekvensering på etablerade modeller för vaskulär utveckling.
En väl karakteriserad modell för att undersöka vaskulär utveckling är murin retinal vaskulär utvecklingsmodell. Murin retinal vaskulatur utvecklas postnatalt i en tvådimensionell ytlig plexus, med initial angiogen spridning från synnerven synlig vid postnatal dag (P)3, angiogen front med stjälk- och spetsceller och initial kärlmognad synlig vid P6 och mognad av vaskulär plexus synlig efter P9 8,9. Under ombyggnaden av den initiala vaskulära plexusen genomgår endotelceller specifikation mot arteriella, kapillära och venösa fenotyper i olika kärl för att generera ett cirkulationsnätverk10,11. Därför tillåter denna metod forskare att visualisera angiogen vaskulär plexusbildning och endotelial arteriell-venös specifikation och mognad vid olika tidpunkter under utveckling9. Dessutom tillhandahåller denna modell en metod för att undersöka effekterna av transgen manipulation på angiogenes och vaskulär plexusutveckling, som har tillämpats för undersökning av vaskulär utveckling, arteriell-venös missbildningar och syreinducerad neovaskularisering 12,13,14,15,16 . För att kombinera nästa generations sekvenseringsmetoder med murin retinal vaskulär utvecklingsmodell krävs ett optimerat protokoll för isolering av endotelceller från näthinnevävnad.
Detta protokoll beskriver en optimerad metod för att smälta näthinnevävnad från möss vid P6 för att maximera cellutbyte, renhet och livskraft. Retinal vävnad isoleras från P6-mus, smälts i 20 minuter, immunbesudlas för CD31 och CD45 och renas genom FACS för att isolera en enda cellsuspension av endotelceller på cirka 2,5 timmar (figur 1A). Dessa endotelceller visade sig upprätthålla hög livskraft i 60 minuter efter isolering17, vilket möjliggjorde biblioteksförberedelser för nästa generations sekvenseringsmetoder. Dessutom tillhandahålls representativa resultat för FACS-gating och kvalitetskontrollresultat från två separata nästa generations sekvenseringsmetoder som använder detta isoleringsprotokoll: hela transkriptom-RNA-sekvensering och encells RNA-sekvensering. Denna metod gör det möjligt att använda nästa generations sekvenseringsmetoder tillsammans med retinal vaskulariseringsmodellen för att belysa nya mekanismer för vaskulär utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för isolering av endotelceller från postnatal murin retinal vävnad som har optimerats för högt cellantal, renhet och livskraft. Cellrenhet erhålls genom FACS-isolering av endotelcellpopulationer från den smälta encellssuspensionen genom CD31 + / CD45- immunfärgning. Kvaliteten på isoleringen kvantifieras i analyser för viabilitet genom Trypan blå färgning och genuttryck av qPCR för CD31, CD45 och VE-Cadherin (även om VE-Cadherin inte användes för immunfärgning). De kri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tack till Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis och University of Virginia Genome Analysis and Technology Core för deras ansträngning, expertis och råd för att bidra till de presenterade experimenten. Denna studie finansierades av NIH-bidrag till N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) och K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
References
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D’Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
