Isolement de cellules endothéliales rétiniennes murines pour le séquençage de nouvelle génération
Summary
Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes postnatales murines optimisées pour le rendement, la pureté et la viabilité cellulaires. Ces cellules conviennent aux approches de séquençage de nouvelle génération.
Abstract
Les améliorations récentes du séquençage de nouvelle génération ont fait progresser les connaissances des chercheurs en biologie moléculaire et cellulaire, plusieurs études révélant de nouveaux paradigmes en biologie vasculaire. L’application de ces méthodes à des modèles de développement vasculaire nécessite l’optimisation des techniques d’isolement cellulaire à partir de tissus embryonnaires et postnataux. Le rendement, la viabilité et la pureté des cellules doivent tous être maximaux pour obtenir des résultats précis et reproductibles à partir d’approches de séquençage de nouvelle génération. Le modèle de vascularisation rétinienne de souris néonatale est utilisé par les chercheurs pour étudier les mécanismes du développement vasculaire. Les chercheurs ont utilisé ce modèle pour étudier les mécanismes de l’angiogenèse et la spécification du devenir artériel-veineux pendant la formation et la maturation des vaisseaux sanguins. L’application de techniques de séquençage de nouvelle génération pour étudier le modèle de développement vasculaire rétinien nécessite l’optimisation d’une méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes qui maximise le rendement, la viabilité et la pureté cellulaires. Ce protocole décrit une méthode d’isolement, de digestion et de purification des tissus murins de la rétine à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Les résultats indiquent que la population de cellules endothéliales CD31+/CD45- purifiées par FACS est fortement enrichie pour l’expression génique des cellules endothéliales et ne présente aucun changement de viabilité pendant 60 minutes après la FACS. Sont inclus les résultats représentatifs des approches de séquençage de nouvelle génération sur les cellules endothéliales isolées à l’aide de cette méthode, y compris le séquençage de l’ARN en vrac et le séquençage de l’ARN unicellulaire, démontrant que cette méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes est compatible avec les applications de séquençage de la prochaine génération. Cette méthode d’isolement des cellules endothéliales rétiniennes permettra des techniques de séquençage avancées pour révéler de nouveaux mécanismes de développement vasculaire.
Introduction
La capacité à haut débit du séquençage des acides nucléiques via des approches de séquençage de nouvelle génération a grandement fait progresser les connaissances des chercheurs en biologie moléculaire et cellulaire. Ces techniques avancées comprennent le séquençage de l’ARN du transcriptome entier, le séquençage de l’ADN des régions ciblées pour identifier les polymorphismes mononucléotidiques (SNP), le séquençage de l’ADN des facteurs de transcription liés dans le séquençage de l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) ou les régions de chromatine ouvertes dans le dosage pour le séquençage de la chromatine accessible par la transposase (ATAC) et le séquençage de l’ARN unicellulaire1 . En biologie vasculaire, ces progrès ont permis aux chercheurs d’élucider des mécanismes complexes de développement et de maladie, ainsi que de distinguer les modèles d’expression génique le long d’un continuum de phénotypesvariés 2,3. Les expériences futures peuvent définir davantage des mécanismes complexes en combinant le séquençage de nouvelle génération avec des modèles évalués de développement vasculaire, mais les méthodes de préparation des échantillons doivent être compatibles avec les techniques de séquençage avancées.
La qualité, la précision et la reproductibilité des approches de séquençage de nouvelle génération dépendent de la méthode de préparation des échantillons. Lors de l’isolement d’un sous-ensemble de cellules ou de la génération de suspensions unicellulaires à partir de tissus, des méthodes optimales de digestion et de purification sont essentielles pour maximiser le nombre de cellules, la viabilité et la pureté de la population cellulaire 4,5. Cela nécessite un équilibre dans la méthode de digestion: une digestion forte est nécessaire pour libérer les cellules du tissu et obtenir suffisamment de cellules pour les approches en aval, mais la viabilité cellulaire sera affectée négativement si la digestion est trop forte 6,7. De plus, la pureté de la population cellulaire est nécessaire pour obtenir des résultats robustes et une analyse précise des données, ce qui peut être accompli via FACS. Cela souligne l’importance d’optimiser les méthodes d’isolement cellulaire pour appliquer le séquençage de nouvelle génération aux modèles établis de développement vasculaire.
Un modèle bien caractérisé pour étudier le développement vasculaire est le modèle de développement vasculaire murin de la rétine. Le système vasculaire murin de la rétine se développe postnatalement dans un plexus superficiel bidimensionnel, avec une germination angiogénique initiale du nerf optique visible au jour postnatal (P)3, un front angiogénique avec des cellules pédoncules et des pointes et une maturation initiale des vaisseaux visibles à P6, et une maturation du plexus vasculaire visible après P9 8,9. Lors du remodelage du plexus vasculaire initial, les cellules endothéliales subissent une spécification vers les phénotypes artériels, capillaires et veineux dans différents vaisseaux pour générer un réseau circulatoire10,11. Par conséquent, cette méthode permet aux chercheurs de visualiser la formation du plexus vasculaire angiogénique et la spécification et la maturation artério-veineuses endothéliales à différents moments du développement9. De plus, ce modèle fournit une méthode pour étudier les effets de la manipulation transgénique sur l’angiogenèse et le développement du plexus vasculaire, qui a été appliquée pour l’étude du développement vasculaire, des malformations artério-veineuses et de la néovascularisation induite par l’oxygène 12,13,14,15,16 . Afin de combiner les approches de séquençage de nouvelle génération avec le modèle de développement vasculaire murin de la rétine, un protocole optimisé pour l’isolement des cellules endothéliales du tissu rétinien est nécessaire.
Ce protocole décrit une méthode optimisée pour digérer le tissu rétinien de souris à P6 afin de maximiser le rendement, la pureté et la viabilité cellulaires. Le tissu rétinien est isolé chez des souris P6, digéré pendant 20 minutes, immunocoloré pour CD31 et CD45 et purifié par FACS pour isoler une suspension unicellulaire de cellules endothéliales en environ 2,5 heures (Figure 1A). Ces cellules endothéliales se sont avérées maintenir une viabilité élevée pendant 60 minutes après l’isolement17, ce qui a permis de préparer la bibliothèque pour les méthodes de séquençage de nouvelle génération. De plus, des résultats représentatifs sont fournis pour les résultats de contrôle et de contrôle de la qualité FACS provenant de deux méthodes distinctes de séquençage de nouvelle génération utilisant ce protocole d’isolation : le séquençage de l’ARN du transcriptome entier et le séquençage de l’ARN unicellulaire. Cette méthode permet d’utiliser des approches de séquençage de nouvelle génération en conjonction avec le modèle de vascularisation rétinienne pour élucider de nouveaux mécanismes de développement vasculaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode d’isolement des cellules endothéliales à partir du tissu rétinien murin postnatal qui a été optimisée pour un nombre élevé de cellules, une pureté et une viabilité. La pureté cellulaire est obtenue par isolement FACS de populations de cellules endothéliales à partir de la suspension unicellulaire digérée par immunomarquage CD31+/CD45-. La qualité de l’isolement est quantifiée dans les essais de viabilité par coloration au bleu de trypan et expression génique par qP…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Merci au Yale Flow Cytometry Facility, au Flow Cytometry Core Facility de l’Université de Virginie, au Yale Center for Genomic Analysis et au Genome Analysis and Technology Core de l’Université de Virginie pour leurs efforts, leur expertise et leurs conseils dans la contribution aux expériences présentées. Cette étude a été financée par des subventions des NIH à N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) et K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
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