Isolering av murine retinale endotelceller for neste generasjons sekvensering
Summary
Denne protokollen beskriver en metode for isolering av murine postnatale retinale endotelceller optimalisert for celleutbytte, renhet og levedyktighet. Disse cellene er egnet for neste generasjons sekvenseringsmetoder.
Abstract
Nylige forbedringer i neste generasjons sekvensering har avansert forskernes kunnskap om molekylær og cellulær biologi, med flere studier som avslører nye paradigmer i vaskulær biologi. Bruk av disse metodene til modeller for vaskulær utvikling krever optimalisering av celleisolasjonsteknikker fra embryonale og postnatale vev. Celleutbytte, levedyktighet og renhet må alle være maksimale for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater fra neste generasjons sekvenseringsmetoder. Neonatal mus retinal vaskulariseringsmodell brukes av forskere til å studere mekanismer for vaskulær utvikling. Forskere har brukt denne modellen til å undersøke mekanismer for angiogenese og arteriell venøs skjebnespesifikasjon under blodkardannelse og modning. Bruk av neste generasjons sekvenseringsteknikker for å studere retinal vaskulær utviklingsmodell krever optimalisering av en metode for isolering av retinale endotelceller som maksimerer celleutbyttet, levedyktighet og renhet. Denne protokollen beskriver en metode for murine retinal vevsisolering, fordøyelse og rensing ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Resultatene indikerer at den FACS-rensede CD31 + / CD45- endotelcellepopulasjonen er svært beriket for endotelcellegenuttrykk og viser ingen endring i levedyktighet i 60 minutter etter FACS. Inkludert er representative resultater av neste generasjons sekvenseringsmetoder på endotelceller isolert ved hjelp av denne metoden, inkludert bulk RNA-sekvensering og encellet RNA-sekvensering, noe som viser at denne metoden for retinal endotelcelleisolasjon er kompatibel med neste generasjons sekvenseringsapplikasjoner. Denne metoden for retinal endotelcelleisolasjon vil tillate avanserte sekvenseringsteknikker for å avsløre nye mekanismer for vaskulær utvikling.
Introduction
Den høye gjennomstrømningskapasiteten til sekvensering av nukleinsyrer via neste generasjons sekvenseringsmetoder har i stor grad avansert forskernes kunnskap om molekylær og cellulær biologi. Disse avanserte teknikkene inkluderer hele transkriptom-RNA-sekvensering, DNA-sekvensering av målrettede regioner for å identifisere Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), DNA-sekvensering av bundne transkripsjonsfaktorer i Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) sekvensering, eller åpne kromatinregioner i Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) sekvensering og enkeltcellet RNA-sekvensering1 . I vaskulær biologi har disse fremskrittene gjort det mulig for forskere å belyse kompliserte mekanismer for utvikling og sykdom, sammen med å skille genuttrykksmønstre langs et kontinuum av varierende fenotyper 2,3. Fremtidige eksperimenter kan videre definere komplekse mekanismer ved å kombinere neste generasjons sekvensering med evaluerte modeller for vaskulær utvikling, men metodene for prøvepreparering må være kompatible med de avanserte sekvenseringsteknikkene.
Kvaliteten, nøyaktigheten og reproduserbarheten av neste generasjons sekvenseringsmetoder avhenger av metoden for prøvepreparering. Når du isolerer en delmengde av celler eller genererer enkeltcellesuspensjoner fra vev, er optimale fordøyelses- og rensemetoder avgjørende for å maksimere cellenummer, levedyktighet og renhet av cellepopulasjonen 4,5. Dette krever en balanse i fordøyelsesmetoden: sterk fordøyelse er nødvendig for å frigjøre celler fra vevet og få nok celler til nedstrøms tilnærminger, men cellens levedyktighet vil bli negativt påvirket hvis fordøyelsen er for sterk 6,7. I tillegg er renhet av cellepopulasjonen nødvendig for robuste resultater og nøyaktig analyse av data, som kan oppnås gjennom FACS. Dette fremhever viktigheten av å optimalisere celleisolasjonsmetoder for å anvende neste generasjons sekvensering på etablerte modeller for vaskulær utvikling.
En godt karakterisert modell for å undersøke vaskulær utvikling er murine retinal vaskulær utviklingsmodell. Murine retinal vaskulatur utvikler seg postnatalt i en todimensjonal overfladisk plexus, med initial angiogen spiring fra synsnerven synlig på barseldag (P)3, angiogen front med stilk- og spissceller og initial karmodning synlig ved P6, og modning av vaskulær plexus synlig etter P9 8,9. Under ombyggingen av den første vaskulære plexus gjennomgår endotelceller spesifikasjon mot arterielle, kapillære og venøse fenotyper i forskjellige kar for å generere et sirkulasjonsnettverk10,11. Derfor tillater denne metoden forskere å visualisere angiogen vaskulær plexusdannelse og endotelial arteriell venøs spesifikasjon og modning på ulike tidspunkter under utvikling9. I tillegg gir denne modellen en metode for å undersøke effekten av transgen manipulasjon på angiogenese og vaskulær plexusutvikling, som har blitt brukt til undersøkelse av vaskulær utvikling, arterielle venøse misdannelser og oksygenindusert neovaskularisering 12,13,14,15,16 . For å kombinere neste generasjons sekvenseringsmetoder med murine retinal vaskulær utviklingsmodell, er det nødvendig med en optimalisert protokoll for isolering av endotelceller fra retinalt vev.
Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for å fordøye retinalvev fra mus ved P6 for å maksimere celleutbytte, renhet og levedyktighet. Retinalt vev isoleres fra P6-mus, fordøyes i 20 minutter, immunostaineres for CD31 og CD45, og renses gjennom FACS for å isolere en enkeltcellesuspensjon av endotelceller i ca. 2,5 timer (figur 1A). Disse endotelcellene ble funnet å opprettholde høy levedyktighet i 60 minutter etter isolasjon17, noe som gjorde det mulig å forberede bibliotekforberedelser for neste generasjons sekvenseringsmetoder. I tillegg er det gitt representative resultater for FACS-gating- og kvalitetskontrollresultater fra to separate neste generasjons sekvenseringsmetoder ved bruk av denne isolasjonsprotokollen: hel transkriptom RNA-sekvensering og encellet RNA-sekvensering. Denne metoden gjør det mulig å bruke neste generasjons sekvenseringsmetoder i forbindelse med retinal vaskulariseringsmodellen for å belyse nye mekanismer for vaskulær utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen beskriver en metode for isolering av endotelceller fra postnatal murine retinalt vev som er optimalisert for høyt celletall, renhet og levedyktighet. Cellerenhet oppnås ved FACS-isolering av endotelcellepopulasjoner fra fordøyd enkeltcellesuspensjon ved CD31 + / CD45- immunostaining. Kvaliteten på isolasjon kvantifiseres i analyser for levedyktighet ved Trypan blå farging og genuttrykk av qPCR for CD31, CD45 og VE-Cadherin (selv om VE-Cadherin ikke ble brukt til immunostaining). De kritiske trinnen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Takk til Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis og University of Virginia Genome Analysis and Technology Core for deres innsats, kompetanse og råd for å bidra til de presenterte eksperimentene. Denne studien ble finansiert av NIH-tilskudd til N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) og K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
References
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D’Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
