Summary
Realtidscellmetabolisk flödesanalys mäter syreförbrukningshastigheten och extracellulär försurningshastighet, vilket motsvarar mitokondriell och glykolytisk adenosintrifosfatproduktion, med hjälp av pH- och syresensorer. Manuskriptet förklarar en metod för att förstå osteoblasternas energistatus och karakteriseringen och tolkningen av den cellulära bioenergetiska statusen.
Abstract
Benbildning av osteoblaster är en viktig process för korrekt benförvärv och benomsättning för att upprätthålla skeletthomeostas och i slutändan förhindra fraktur. I intresse för att både optimera toppbenmassan och bekämpa olika muskuloskeletala sjukdomar (dvs. postmenopausal osteoporos, anorexia nervosa, typ 1 och 2 diabetes mellitus) har otroliga ansträngningar gjorts inom benbiologi för att fullt ut karakterisera osteoblaster under hela deras differentieringsprocess. Med tanke på den primära rollen hos mogna osteoblaster för att utsöndra matrisproteiner och mineraliseringsblåsor har det noterats att dessa processer tar en otrolig mängd cellulär energi eller adenosintrifosfat (ATP). Den övergripande cellulära energistatusen kallas ofta cellulär bioenergetik, och den innehåller en serie metaboliska reaktioner som känner av substrattillgänglighet för att härleda ATP för att möta cellulära behov. Därför beskriver den nuvarande metoden processen att isolera primära, murina benmärgsstromalceller (BMSC) och övervaka deras bioenergetiska status med hjälp av realtidscellmetabolisk flödesanalysator i olika stadier i osteoblastdifferentiering. Viktigt är att dessa data har visat att den metaboliska profilen förändras dramatiskt under osteoblastdifferentiering. Således krävs användning av denna fysiologiskt relevanta celltyp för att fullt ut uppskatta hur en cells bioenergetiska status kan reglera den övergripande funktionen.
Introduction
Benbildningen av osteoblasten åtföljs av samordnad förstörelse eller resorption av ben genom osteoklaster. Balansen mellan osteoblastisk benbildning och osteoklastresorption är en kopplad process som beskriver benomsättning eller ombyggnad, vilket är viktigt för skeletthomeostas. Osteoblastdysfunktion leder till nedsatt benbildning och resulterar i olika sjukdomar, inklusive osteoporos 1,2,3. Ex vivo/in vitro-differentiering av benmärgsstromala stamceller (BMSC) till osteoblastprekursorer och mogna osteoblaster resulterar i bildandet och avsättningen av den mineraliserade benmatrisen i odlingskärlet över tid 4,5,6. Denna benbildning av osteoblasten kräver en betydande mängd cellulär energi. Specifikt har kollagensyntes och utsöndring visat sig vara starkt beroende av cellulär ATP: ADP-förhållanden, och förmodligen kräver mineraliserad vesikolhandel och utsöndring ytterligare ATP 7,8,9,10,11. Många forskare har visat att processen med osteoblastogenes och osteoblastfunktion kräver en tillräcklig energiförsörjning för att möta den metaboliska efterfrågan på benbildning 12,13,14,15,16. Därför är målet med denna metod att karakterisera den bioenergetiska statusen för primära, murina stromala celler under osteoblastdifferentiering med användning av realtidscellmetabolisk flödesanalysator. Dessa tekniker hjälper till att utveckla en bättre förståelse för skeletthomeostas, vilket i slutändan kan leda till utvecklingen av nya terapeutiska alternativ som kan förbättra skelettsjukdomar.
Realtidscellmetabolisk flödesanalysator kan användas för att mäta syreförbrukningshastigheten (OCR) och extracellulär försurningshastighet (ECAR) för levande osteoblaster, vilket motsvarar mitokondriell respektive glykolytisk ATP-produktion. Grundläggande för denna metod är det faktum att en H + -jon per laktat frigörs under glykolys vid omvandling av glukos till laktat, vilket förändrar medias pH som återspeglas i ECAR-värdena. Omvänt, under TCA-cykeln (trikarboxylsyra), producerar oxidativ fosforylering via mitokondrierna CO2 genom att använda eller konsumera syre, och därför är övervakning av OCR reflekterande av denna metaboliska process. Analysatorn mäter både OCR och ECAR i den extracellulära mikromiljön samtidigt och i realtid, vilket möjliggör enorm potential när man studerar cellulär bioenergetik 6,17. Dessutom är det relativt enkelt att utföra dessa analyser och lätt anpassningsbart beroende på det experimentella målet. Liknande tekniker har använts för att ytterligare förstå T-cellsmetabolisk reglering av immunsystemet18,19, cancerinitiering och progression20, tillsammans med flera andra celltyper som bidrar till metaboliska syndrom21,22.
Fördelarna med metabolisk flödesanalysator i realtid jämfört med alternativa tekniker inkluderar (1) förmågan att mäta cellulär bioenergetik hos levande celler i realtid, (2) förmåga att utföra analys med ett relativt litet antal celler (kräver så lågt som 5 000 celler), (3) injektionsportar för att parallellt manipulera flera behandlingar i ett 96-brunnssystem med hög genomströmning, (4) användning av radioaktiv etikettfri automatiserad cellbildare för normalisering18, 23,24. Följande metoder syftar till att ge en generaliserad men detaljerad beskrivning av övervakning av cellulär bioenergetik i murina BMSC under osteoblastdifferentiering med hjälp av analysatorn. Det kommer att innehålla rutinmässigt utförda analyser; Men som med många tekniker och metoder uppmuntras det starkt att enskilda laboratorier bestämmer specifika detaljer för sina experiment.
Urval av analyser och olika typer av analyser tillgängliga: Ett brett utbud av analyssatser och reagenser finns tillgängliga för att studera cellernas bioenergetik samtidigt som tillförlitligheten och konsistensen av de experimentella resultaten säkerställs. Dessutom erbjuder skrivbordsprogramvaran också analysmallar som enkelt kan anpassas. Analysen kan definieras utifrån användarens behov av att mäta olika metaboliska parametrar. Dessa analyser kan modifieras på olika sätt baserat på det experimentella målet och / eller den vetenskapliga frågan. Till exempel, med fyra injektionsportar, kan flera föreningar injiceras i analysmediet för att analysera det cellulära svaret som är specifikt för varje metabolisk väg.
Cellenergi fenotyp test: Denna analys mäter de levande cellernas metaboliska fenotyp och metaboliska potential. Denna analys rekommenderas också som det första steget för att få en generaliserad uppfattning om vägspecifik metabolism. En blandning av oligomycin A-en-hämmare av ATP-syntas och karbonylcyanid 4-(trifluormetoxi) fenylhydrazon (FCCP) - ett mitokondriellt frikopplingsmedel injiceras för att förstå cellenergipotentialen. Injektionen av oligomycin A hämmar syntesen av ATP, vilket resulterar i en ökning av glykolyshastigheten (ECAR) för att göra det möjligt för cellerna att uppfylla sina energibehov; å andra sidan resulterar injektionen av FCCP i högre OCR på grund av depolarisering av mitokondriellt membran. I huvudsak visar denna analys basal metabolisk andning, och efter de dubbla injektionerna, tryck eller påfrestningar, det metaboliska svaret. Baserat på dessa parametrar plottar programvaran sedan OCR och ECAR av cellerna genom att klassificera cellerna som aeroba, vilande, glykolytiska eller energiska tillstånd över tiden25,26.
ATP-analys av produktionshastighet i realtid: Detta mäter den cellulära ATP-produktionen samtidigt från glykolys och mitokondriell andning. Denna analys mäter kvantitativt de metaboliska förändringarna från de två energivägarna och ger data om mitokondriella och glykolytiska ATP-produktionshastigheter över tiden. Analysen erhåller basala OCR- och ECAR-data följt av beräkning av mitokondriell ATP-produktionshastighet genom injektion av oligomycin A och glykolytisk ATP-produktionshastighet genom injektion av rotenon + antimycin A-blandning (total hämning av mitokondriell funktion), vilket resulterar i mitokondriell försurning17,27.
Stresstest för cellmitokondrier (eller stresstest för cellmito): Detta mäter mitokondriell funktion genom ATP-kopplad andning, kvantifierar cellulär bioenergetik, identifierar mitokondriell dysfunktion och mäter cellernas svar på stress. Olika parametrar, inklusive basal och reserv andningskapacitet, ATP-kopplad andning, maximal andning och icke-mitokondriell syreförbrukning, kan erhållas i en analys. Denna analys innefattar sekventiella injektioner av oligomycin A, FCCP (mitokondriellt frikopplingsmedel), en blandning av rotenon/antimycin A-hämmare för att effektivt analysera effekten av dessa på mitokondriell funktion28.
Flexibilitet mito bränsle flex test: Detta mäter mitokondriell andningshastighet genom oxidation av de tre primära mitokondriella bränslena genom närvaron och frånvaron av deras hämmare. Den sekventiella hämningen av glukos, glutamin och fettsyror hjälper till att mäta cellernas beroende, kapacitet och flexibilitet och cellernas beroende i olika cellulära vägar för att möta energibehovet. När mitokondrierna inte kan uppfylla kraven från den blockerade vägen av intresse genom att oxidera andra bränslen, går cellerna in i ett beroendetillstånd. Cellernas kapacitet beräknas genom hämning av de andra två alternativa vägarna följt av hämning av den intressanta vägen. Cellernas flexibilitet hjälper till att förstå mitokondriernas förmåga att kompensera och möta bränslebehoven hos den hämmade vägen. Det beräknas genom att subtrahera cellernas beroende från cellernas kapacitet. Tre olika hämmare används oberoende eller som en blandning av två för att effektivt beräkna analysparametrarna. 2-cyano-3-(1-fenyl-1H-indol-3-yl)-2-propensyra (UK5099) hämmar oxidationen av glukos genom att blockera pyruvatbäraren vid glykolys. Bis-2-(5-fenylacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-yl) (BPTES) etylsulfid hämmar glutaminoxidationsvägen och etomoxir hämmar oxidationen av långkedjiga fettsyror29.
Figur 1: Schematisk representation av metoden för odling och beredning av osteoblaster för analys. Murina BMSC isoleras från långa ben, odlas och frös i 96-brunnsplattor vid 25 000 celler / brunnsdensitet. Odling av dessa celler i osteoblastspecifika medier startas när de når 80% -100% sammanflöde för att starta sin differentiering. Analyserna utförs i olika stadier av differentiering. Patronplattorna hydreras en dag före analysen. På analysdagen injiceras olika hämmare i portarna på sensorpatronerna baserat på analyskraven, och en kalibreringsbuffert läggs till 96-brunnskalibreringsplattan. Efter kalibrering utförs realtidscellens metaboliska flödesanalys, följt av avbildning av cellodlingsmikroplattan med hjälp av mikroplattbildaren för att normalisera realtidsdata för cellmetaboliska flödesanalysatorer med cellantal. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden baserades på riktlinjerna och godkännandet av Institutional Animal Care and Use Committee vid Vanderbilt University Medical Center.
1. Beredning av reagenser och analysuppställning
- Isolering och odling av benmärgsstromaceller (se även föregående artikel30).
- Förbered fullständigt alfa minimum essential media (αMEM) cellodlingsmedier genom att komplettera minsta essentiella medier med alfamodifiering med 10% FBS (fetalt bovint serum), 100 U / ml penicillin och 100 μg / ml streptomycin.
- Förbered benmärgsuppsamlingsröret genom att trimma änden av ett 0,6 ml mikrocentrifugrör så att cellerna kan passera igenom och sätta in det i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 100 μL komplett αMEM.
- Avliva mössen med CO2-behandling enligt följande. Placera djuret i CO2-kammaren i 2-3 minuter eller tills andningen upphör. Vänta i minst 1 min efter att djuret blir medvetslöst för att ta bort mössen från kammaren och cervikalt dislokera.
- Skär upp underlivet på de avlivade mössen med sterila pincett och en sax för att göra ett litet snitt. Isolera mössens långa ben (lårben, skenben och iliac crest).
- Trimma de långa benen för att ta bort all mjukvävnad. När benet är rengjort, skär ~ 1-2 mm från de distala och proximala ändarna för att skapa en öppning för märgen att spola igenom.
OBS: Denna öppning bör vara konservativ för att undvika att förlora märgen samtidigt som den kan spola ut. - Placera benen i ett uppsamlingsrör som innehåller 100 μL 1x steril PBS (fosfatbuffrad saltlösning) för att isolera den totala benmärgen.
- Spola märgen genom centrifugering vid 10 000 x g i 15-20 s vid rumstemperatur. Märgceller pellets i botten av röret.
- Upprepa centrifugeringen tills benhålan verkar vit och saknar de flesta märgelement. Resuspend den blandade populationen av benmärg genom att försiktigt pipettera upp och ner.
- Odla cellerna från ett djur (både lårben och skenben) i en 75 cm2 cellodlingskolv i 10 ml cellodlingsmedier och inkubera vid 37 °C i en cellodlingsinkubator med 5 % CO2. Om du samlar celler från 2-3 djur, använd en 150 cm2 cellodlingskolv (rekommenderas).
- Efter 24-48 timmars inkubation av den blandade populationen, aspirera den icke-vidhäftande hematopoietiska cellpopulationen som finns i odlingsmediet och tvätta de vidhäftande cellerna med 1x PBS.
- Cellsädning från BMSC och osteoblastdifferentiering
- Trypsinisera de vidhäftande cellerna genom att tillsätta tillräckligt med 0,25% trypsin- EDTA (ca 3-4 ml) för att täcka kolvytan något, följt av en 3 minuters inkubation vid 37 ° C.
- Tillsätt 6-7 ml komplett αMEM till kolven/trypsinet för att återanvända de vidhäftande BMSC:erna genom att försiktigt pipettera upp och ner. Överför BMSC-suspension till ett koniskt centrifugrör.
- Ta bort en 50 μL alikvot av BMSC-suspensionen och tillsätt 50 μL trypanblå (1: 1 utspädning) till den. Räkna det totala antalet livskraftiga celler som utesluter färgämnet genom att pipettera 10 μL av denna blandning på en hemocytometer och observera den under mikroskopet. Räkna inte med döda eller ohälsosamma celler som verkar blåfärgade (<10% celler).
- Baserat på cellantalet, beräkna volymen av cellsuspension i fullständig αMEM som behövs för en slutlig koncentration av 2,4 x 106 celler / ml för en total volym på minst 10 ml per platta.
Figur 2: Cellodlingsmikroplattan, speciellt utformad för analysatorn. (A) De fyra bakgrundskorrigeringsbrunnarna, A1, A12, H1, H12, markeras. Dessa brunnar innehåller endast analysmedier utan några celler. (B) Streckkoden på sidan av plattan för att skanna plattan med hjälp av bildläsaren och analysatorn. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Centrifugera cellerna i det koniska röret vid 1000 x g i 5 min och återsuspendera cellerna till önskad slutlig koncentration på 2,4 x 106 celler / ml.
- Överför cellsuspensionen till en behållare och, med hjälp av en flerkanalig pipett, försiktigt resuspendera cellerna för att säkerställa en homogen blandning av celler.
- Frö 2,5 x 104 celler per brunn i 96-brunns cellodlingsmikroplattan med 80 μL komplett αMEM. Frö inte celler i bakgrundskorrigeringsbrunnarna (A1, A12, H1, H12); lägg istället bara till mediet i dessa fyra brunnar.
OBS: BMSC för analyserna är pläterade i 96-brunns cellodlingsmikroplatta utformad för analysatorn i kombination med sensorpatronerna. Ytan på dessa plattor skiljer sig från en vanlig 96-brunnsplatta. Ytan på varje brunn i plattan är 0,106 cm2, vilket är cirka 40% av den typiska 96-brunnsplattan. Optimal cellsåddensitet väljs utifrån celltypen. Vanligtvis kan analysatorn detektera mellan 0,5-4 x 104 celler per brunn. Osteoblaster måste vara i kontakt för att differentiera effektivt; För detta ändamål har plätering mellan 2,0 x 10 4-3,0 x 104 BMSC/brunn i 80 μL komplett αMEM valts. - Rör försiktigt om plattan för att säkerställa en jämn fördelning av celler i brunnarna och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2. Kontrollera tillväxten av cellerna och cellkonfluensen under mikroskopet efter 48 timmar. Ändra cellodlingsmediet om det behövs.
- Beroende på målet med analysen, när BMSC är 60% -80% sammanflytande (typiskt 48-72 timmar), initiera osteoblastdifferentiering genom att ändra cellodlingsmediet till osteoblastdifferentieringsmedier (komplett αMEM kompletterat med 5 mM β-glycerolfosfat och 50 μg / ml L-askorbinsyra).
- Om odifferentierade stromaceller (dag 0) ska analyseras, behåll cellerna under fullständig αMEM.
- Ändra osteoblastdifferentieringsmediet varannan dag och visualisera cellerna under mikroskopet för att säkerställa att de är friska fram till analysdagen. Helst, 24 timmar före den schemalagda analysen, byt media och upprätthålla ett konsekvent medium förändringsschema (rekommenderas).
OBS: Byt försiktigt media genom att luta plattorna något i en vinkel; detta undviker oavsiktlig kontakt med pipettspetsar till cellodlingsplattorna och störning av monoskiktet av celler.
2. Förberedelse av sensorpatron för extracellulär flödeskalibrering
- Hydrera sensorpatronerna från det extracellulära analyspaketet före analysdagen. Ta bort sensorpatronerna (grön platta) och placera sensorerna upp och ner.
- Använd en flerkanalig pipett, tillsätt 200 μLH2Otill varje brunn på verktygsplattan. Placera försiktigt tillbaka sensorpatronerna på verktygsplattan och inkubera plattan över natten vid rumstemperatur.
OBS: Tillverkaren rekommenderar att sensorpatronerna inkuberar i en icke-CO2 37 ° C inkubator över natten. Emellertid kan betydande avdunstning av sensorpatronerna inträffa. Om detta händer kan sensorpatroner inkuberas vid rumstemperatur. Dessa plattor ska inkuberas i minst 4 timmar och högst 72 timmar. - På analysdagen kasserar duH2Ofrån verktygsplattan och tillsätt 200 μL kaliber. Inkubera verktygsplattan i minst 1 timme före analysen.
3. Beredning av cellmetaboliskt flödesanalysatormedier i realtid
- Använd det fenolröda fria DMEM-mediet med ett förjusterat pH på 7,4 (rekommenderas) för att köra analysen med BMSC.
- Förbered 80 ml analysmedia genom att komplettera DMEM-media med 1 mM natriumpyruvat, 2 mM glutamin, 10 mM glukos, 200 nM insulin, 50-200 μM oljesyra BSA.
- Inkubera hela analysmediet vid 37 °C i ett vattenbad.
4. Beredning av föreningar för sensorpatronerna
- Tina oligomycin A, rotenon och antimycin A på is. Pipett upp och ner för att solubilisera föreningarna före användning.
- Tillsätt 3 ml beredd analysmedium till varje rör, följt av tillsats av respektive föreningsrör A: 26,4 μL av 2,5 mM oligomycin A; rör B: 3,1 μL av 12,67 mM rotenon + 4,1 μL av 9,4 mM antimycin A + 30 μL Hoechst-fläck.
- Ladda en 10x koncentration av dessa hämmare i motsvarande port. Den slutliga koncentrationen av injektionslösningar som behövs är 2 μM oligomycin A, 1 μM rotenon och 4,1 μM antimycin A.
OBS: Hoechst läggs till den slutliga injektionsporten för fluorescerande färgning av kärnorna för avbildning och normalisering. Dessa koncentrationer kan optimeras baserat på celltypen. - Ladda 20 μL av dessa föreningar i cellerna i 180 μL analysmedia.
5. Förbered cellodlingsmikroplattan för analys
- Ta bort cellodlingsmikroplattan från 37 ° C-inkubatorn och observera cellerna under mikroskopet.
- Ta bort analysmediet från vattenbadet.
- Tvätta försiktigt cellerna med 200 μL analysmedium två gånger och tillsätt 200 μL analysmedia per brunn.
OBS: När det slutliga analysmediet har lagts till cellerna är tiden tills plattorna kommer in i analysatorn avgörande. Börja därför inte byta ut mediet förrän följande steg har utförts inom 1 timme. - Kontrollera cellerna under mikroskopet för att säkerställa att cellerna förblir vidhäftade vid brunnarna.
- Se till att celler i D5 och E8 fästs med ett konsekvent monolager och inte tvättas bort under tvättsteget. Cellbildsprogramvara använder dessa två brunnar för att ställa in autofokus och autoexponering.
OBS: Tillverkaren rekommenderar att plattan inkuberars i en icke-CO2 37 ° C inkubator i 1 timme; det här steget kan hoppas över om automatiserad avbildning är att föredra. Till exempel upprätthåller mikroplattbilden samma förhållanden i en sluten kammare, och celler kan avbildas under ett ljusfält.
6. Ställa in analysen och avbildningen
Bild 3: Styrenhetens programvara. Programvaran verifierar att utrustningen är ansluten och är inställd på 37 °C. Mallfilerna för olika analyser som kan utföras med den extracellulära flödesanalysatorn kan väljas för att anpassa analysen ytterligare baserat på de experimentella målen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Öppna skrivbordsprogramvaran i datorn bredvid utrustningen.
- Kontrollera anslutningsstatusen i det nedre vänstra hörnet av styrenhetens programvara.
- Gå till Mallar och välj mallfilen XF ATP Rate Assay eller lämplig analysmall.
- Välj Gruppdefinitioner överst på skärmen och definiera grupperna.
- Välj plattkartlayouten och tilldela brunnarna beroende på vilka grupper som definierats.
- Kontrollera instrumentprotokollet, se till att de tillsatta föreningarna är korrekt listade och inkludera projektinformationen för framtida referenser.
- Klicka på Kör analys; Detta kommer att uppmana valet av resultatfilens lagringsplats.
- Välj den plats där resultatfilen ska sparas.
- Spara filen med analysdatumet och klicka på Starta körning.
- Placera sensorpatronen och verktygsplattan på facket och klicka på Jag är redo att starta kalibreringen.
- Innan du påbörjar kalibreringen , se till att patronlocket är borttaget och sensorpatronen är placerad i rätt riktning på verktygsplattan. Det här steget tar 10-20 minuter, och när det är klart visar programvaran dialogrutan Load Cell Plate .
7. Skaffa ljusfältsbilder
OBS: Det här steget är valfritt. Om det inte finns någon bildåtergivningsutrustning går du vidare till steg 8.
Figur 4: Cellavbildningsprogrammet kommunicerar med bildläsaren via datorn. Cellerna i mikroplattan kan avbildas före och efter analysen, och cellräkningen /brunnen erhålls efter analysen för att normalisera data. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Öppna cellavbildningsprogramvaran på datorn.
- Se till att mikroplattbilden är påslagen och att portarna är anslutna till datorn.
- Kontrollera statusfältet längst ned till vänster på skärmen för att säkerställa att temperaturen är inställd på 37 °C och att anslutningsstatusen ska markeras i grönt som klar.
- Skanna plattans streckkod för att initiera avbildningsprocessen.
- Ange ett namn på cellplattan och tryck på Spara (Det här är namnet där både ljusa fält och fluorescerande bilder sparas). Klicka på Utför Brightfield Scan.
- Nästa skärm, platta och skanningsmeny visar alternativen för bildbehandling. Innan analysen väljer du Starta Brightfield Scan.
- Placera cellodlingsmikroplattan tillsammans med plattkåpan/locket på brickhållaren och rikta in väl A1 mot A1-märket. Klicka på Stäng facket.
- Nästa skärm, brightfield image acquisition, med en plattkarta visas. Klicka på Skanna alla brunnar, som initierar systeminitieringsprocessen följt av 30 till 35 minuter av en skanning.
- Efter ljusfältsskanningen, ta bort cellodlingsmikroplattan och placera den i analysatorn för att utföra analysen.
8. Köra analysen
- När kalibreringen är klar visar programvaran dialogrutan Load Cell Plate .
- Klicka på Öppna facket för att ersätta verktygsfacket med en cellodlingsmikroplatta. Se till att locket är borttaget och att plattans A1 passar i rätt riktning.
- Klicka sedan på Ladda cellplatta för att starta analysen. Sensorpatronen kommer att förbli inne i analysatorn för analysinjektionerna.
- Vänta tills analysen startar och visar den beräknade tiden för slutförande.
- När analysen är klar visar programvaran dialogrutan Lossa sensorpatron . Klicka på Mata ut och ta bort cellodlingsmikroplattan från analysatorn.
- Ta försiktigt bort sensorpatronen och sätt tillbaka locket på cellplattan. Cellerna är redo för fluorescerande avbildning och cellräkning.
- När du har tagit bort cellplattan och sensorpatronen visas dialogrutan Analys slutförd .
- Klicka på Visa resultat för att öppna analysresultatfilen och normalisera data omedelbart eller klicka på Hem.
9. Skaffa fluorescensbilder och normalisera
OBS: Detta steg är en valfri men föredragen metod för normalisering av BMSC och osteoblaster. Om ingen bildutrustning finns tillgänglig måste en annan normaliseringsmetod utföras, såsom protein- eller DNA-isolering och kvantifiering.
Figur 5: Representativa bilder från bildbehandlingsprogramvaran som används för normalisering av data från analysen. (A) Sydd ljusfältsbild som visar cellsammanflödet genom hela brunnen. (B) Sydd fluorescensbild som visar Hoechst-färgade kärnor av osteoblaster som används för att räkna cellnummer för att normalisera analysresultaten. Dessa är osteoblaster efter 7 dagars differentiering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- När analysen är klar skannar du plattans streckkod med den handhållna streckkodsläsaren. Om plattan redan har avbildats kräver den inte ett nytt namn.
- Välj Fluorescens & Cell Count, placera cellplattan på brickhållaren och klicka på Stäng facket.
- I fönstret för bildförvärv väljer du Skanna alla brunnar för att påbörja avbildningen. Fluorescensavbildning tar cirka 15-20 minuter att skanna hela plattan. Observera den gröna bockmarkeringen som anger att skanningen har slutförts.
- Granska de fluorescerande bilderna och cellantalet i bild- och cellavbildningsprogrammet genom att slumpmässigt klicka på ett par av brunnarna.
DET FINNS ETT ALTERNATIV ATT VISA RÄKNADE CELLER LÄNGST NED TILL HÖGER PÅ SKÄRMEN. Det här alternativet visar en maskerad bild som markerar de objekt som räknades. - När fluorescensavbildningen är klar exporterar du bilderna för ytterligare referenser.
- När avbildningen och cellräkningen är klar öppnar du resultatfilen och klickar på Normalisera. Normaliseringsskärmen ger plattlayouten och ett alternativ för att importera cellräkningen.
- Klicka på Importera och välj Ansök om skrivbordsprogramvaran för att normalisera analysen med cellantal automatiskt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 6: Representativa grafer för rutinmässigt utförda analyser för att förstå den cellulära bioenergetiska profilen för kontroll kontra behandlingsgrupp med deras respektive standardfel. (A) Cellenergifenotyptestet. Diagrammet representerar glykolysen (ECAR) kontra mitokondriell andning (OCR) av kontrollen kontra två behandlingsgrupper (n = 3). Injektionen av oligomycin A och FCCP stressorer höjer baslinjeaktiviteten, indikerad med öppna symboler, medan slutna symboler indikerar cellernas svar på olika stressfaktorer. (B) ATP-hastighetsanalys i realtid. ATP-hastighetsanalysen indikerar att både kontroll- och behandlingsgrupperna (n = 2) producerar mer ATP genom glykolys jämfört med oxidativ fosforylering. (C) Mito-stresstestet. Mito-stresstestet ger mitokondriell andningshastighet för kontroll kontra behandlingsceller (n = 2) över tid och effekten av hämmare på cellerna efter deras respektive injektioner. (D) Mito fuel flex-provningen. Mito-bränsleflextestet mäter den procentuella oxidationen av kontroll- och behandlingsgrupper (n = 2) med avseende på glukos-, glutamin- och fettsyravägar och cellernas beroende och flexibilitet på dessa mitokondriella bränslen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Protokollet beskriver en generaliserad beskrivning av hur de extracellulära flödesanalyserna hjälper till att förstå cellulär bioenergetik hos osteoblaster härrörande från murina BMSC. Vi har detaljerat dessa rutinmässigt utförda analyser och viktiga anteckningar som ska beaktas före, under och efter analysen. De två stora ATP-produktionsvägarna, glykolys och mitokondriell oxidativ fosforylering, diskuteras allmänt för att bättre förstå cellernas förmåga att utbyta mellan vägarna och därigenom möta cellernas energibehov. När analysen är klar normaliseras analysresultaten baserat på cellräkningen och exporteras till respektive analysrapportgeneratorfil. Rapportgeneratorn beräknar automatiskt analysparametrarna och tillhandahåller en sammanfattande rapport om analysen. Figur 6 illustrerar de representativa resultaten av rutinmässigt utförda analyser för att bättre förstå hur mogna osteoblaster kontrollerar kontra behandlingsgrupper reagerar när olika hämmare injiceras.
Generiska, representativa bilder av möjliga förväntade resultat visas i figur 6. Till exempel, i figur 6A, övervakar cellenergifenotypen OCR kontra ECAR genom att beräkna cellernas baslinjefenotyp, stressad fenotyp och metabolisk potential. Injektionen av oligomycin A och FCCP stressorblandning ökar kontrollgruppens baslinjeaktivitet (öppna symboler) genom att öka utnyttjandet av båda vägarna. Som svar på stressorerna märks en signifikant hög energinivå i kontroll- och behandlingsgruppen 1 (slutna symboler). Å andra sidan hade behandling 2 en jämförelsevis lägre baslinjeaktivitet och cellerna blev mer aeroba. Denna analys hjälper till att förstå cellernas bioenergetik som svar på olika stressfaktorer.
ATP-hastighetsanalys i realtid beräknar den totala cellulära ATP-produktionshastigheten baserat på summan av glykolytiska och mitokondriella ATP-produktionshastigheter.
ATP-produktionshastighet (pmol ATP / min) = glykoATP-produktionshastighet (pmol ATP / min) + mitoATP-produktionshastighet (pmol ATP / min).
Figur 6B indikerar att både kontroll- och behandlingsgrupperna producerar mer ATP genom glykolys jämfört med oxidativ fosforylering. Medan behandlingsgruppen uppvisar signifikant högre total ATP-produktion, har cellerna konsekvent skiftat från glykolytisk till oxidativ metabolism. Denna jämförelse av kontroll- och behandlingsgruppen indikerar att denna specifika behandling uppvisar en annan bioenergetisk profil jämfört med kontrollgruppen.
Figur 6C är ett exempel på mitokondriell andningshastighet över tid, vilket är detaljerat. Basalandningshastigheten i behandlingsgruppen är jämförelsevis lägre än i kontrollgruppen. Andnings- och ATP-produktionshastigheterna i båda grupperna minskar tillsammans med protonläckaget följt av en oligomycin A-injektion. Andningshastigheterna hos cellerna stiger tillbaka igen till sin maximala andning efter injektionen av FCCP. Den slutliga injektionen av rotenon/antimycin A minskar OCR igen, vilket resulterar i extra andning, vilket mäts av skillnaderna i maximal och basal andning. Efter den tredje injektionen stängs mitokondriell andning av genom kombinationen av rotenon/antimycin A, som riktar sig mot och hämmar elektrontransportkedjekomplexet (ETC) I och III, vilket gör det möjligt för oss att beräkna den icke-mitokondriella andningen. Jämfört med kontrollgruppen är både basal och maximal andning i behandlingsgrupperna relativt lägre; detta tyder på att behandlingen kan påverka mitokondriell andning av osteoblaster.
Mito-bränsleflextestet mäter mitokondriernas potential att oxidera de tre olika mitokondriella bränslena, glukos, glutamin och fettsyror. Cellens beroende, flexibilitet och kapacitet på olika vägar som bränner mitokondriell andning beräknas baserat på oxidationen av respektive mitokondriellt bränsle. Figur 6D visar att kontrollgruppen är starkt beroende av glukosvägen. Samtidigt förbättrade behandlingen kapaciteten för glukosoxidation av cellerna för att aktivt möta bränslebehoven hos den hämmade vägen. Å andra sidan var oxidationen av glutamin effektiv i kontrollgruppen, vilket resulterade i jämförelsevis högre beroende av celler till behandlingsgruppens, vilket ökade kontrollgruppens totala kapacitet. Fettsyravägen visar att behandlingen har ökat cellernas totala kapacitet på grund av det högre beroendet av mitokondriellt bränsle samtidigt som bränslebehovet kompenseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Realtidscellens metaboliska flödesanalysator kan användas för att utforska cellulär energi under olika förhållanden. Protokollet illustrerar effektiv isolering av BMSC, odlingsceller i lämpliga cellodlingsplattor och deras differentiering till mogna osteoblaster, som kan användas för olika analyser med hjälp av den extracellulära flödesanalysatorn. Vidare förklaras de kritiska stegen i realtid cellmetabolisk flödesanalys, inklusive hydrering av sensorpatroner, laddning av injektionsportarna, utförande av analysen, normalisering av data och dataanalyser, också i detalj. Denna analys utvärderar osteoblasternas svar på olika mitokondriella och glykolytiska hämmare för att förstå cellernas bioenergetik. Detta protokoll är optimerat specifikt för osteoblaster baserat på celltypen, och denna metod erbjuder en mer robust och exakt guide jämfört med tillverkarens standardprotokoll. Flera parametrar i detta protokoll, inklusive cellsåddensiteten, koncentrationen av föreningarna, tillsats av exogent substrat till mediet, buffertkapacitet, måste optimeras baserat på den specifika celltypen och dess bakgrund.
Den extracellulära flödesanalysatorn ger snabba och tillförlitliga mätningar av cellulära metaboliska funktioner i ex vivo-odlade celler. Jämfört med andra biologiska analyser är den totala analystiden vanligtvis mellan 60 och 120 min. Utrustningen upprätthåller normala cellulära och fysiologiska förhållanden genom att bibehålla den förinställda temperaturen på 37 °C, vilket underlättar effektiva och reproducerbara analysresultat med minskad komplexitet. Vanligtvis registreras ocr och ECAR vid baseline tre till fyra gånger innan hämmare tillsätts. Hämmarna och behandlingarna injiceras också sekventiellt, vilket underlättar cellens metaboliska responsmätning över tiden. Analysatorn gör det möjligt för forskare att uppnå standardiserade resultat under optimerade förhållanden. Analysatorn erbjuder också förmågan att injicera olika föreningar under analysen för att observera realtidsförändringar i cellernas andning. För ATP-hastighetsanalys ska du till exempel använda en 2 μM oligomycin A och 1 μM rotenon/1 μM antimycin A-blandning som standardförening injicerad-Port A: 2 μM Oligomycin A; Port B: 1 μM rotenon/1 μM antimycin A.
Analysmediet skiljer sig från det typiska tillväxtmediet med några faktorer, inklusive frånvaron av bikarbonat för att bättre upptäcka förändringar i pH, frånvaron av glukos-, glutamin- och pyruvattillskott gör det möjligt för experimenteraren att anpassa de exogena substraten tillsatta, och mediet innehåller inte fenolrött för att exakt beräkna pH-värdena.
Glukos, L-glutamin och natriumpyruvat är de mest använda exogena substraten. Användningen av dessa substrat är specifik för celltyp och experimentella frågor. I detta sammanhang är det erkänt att dessa analyser, även om de är värdefulla, utförs med hjälp av ett artificiellt system. Det rekommenderas till exempel att använda 10 mM glukos; Detta är dock suprafysiologiska nivåer, och forskare bör överväga om andra glukoskoncentrationer skulle vara mer lämpliga. Till denna punkt är det också viktigt att överväga om glukosupptaget i BMSC och osteoblaster beror på insulin, och i så fall bör insulin också tillsättas. Eftersom detta fortfarande är ett ämne för debatt inom området31,32 är inkludering av insulin att föredra. Längs en liknande linje, om fettsyrautnyttjandet är relativt den experimentella frågan, bör analysmediet kompletteras ytterligare med fettsyror. Betydelsen av dessa exogena substrat spelar en avgörande roll i analyserna och datatolkningen; Därför bör koncentrationerna av dessa substrat optimeras baserat på celltyp och forskningsfråga.
En av de främsta fördelarna med den extracellulära flödesanalysatorn är att den kräver ett minimalt antal celler för att köra analyserna, med ett högt n givet 96-brunnsformatet. Sensorpatronerna möjliggör också möjligheten att injicera olika hämmare och föreningar genom de fyra injektionsportarna. Flexibiliteten att modifiera analysen, att utföra akuta injektioner med ytterligare hämmare och behandlingar av intresse är en extra fördel med denna teknik. Dessa funktioner gör analysatorn kapabel att göra hög genomströmning, realtidsanalyser på ett minimalt antal celler och därmed att föredra framför den klassiska Clark syreelektrodmetoden. Även om elektrodmetoden är billig och enkel för att mäta mitokondriell andning, ger den mycket högre bakgrundsbrus och har en lägre upplösning än analysatorn24,33.
Dessutom, i det beskrivna arbetsflödet, kan den cellbioenergetiska profilen erhållen från analysatorn effektivt normaliseras med hjälp av mikroplattbildaren genom att räkna cellerna i mikroplattorna efter analysen34. Antalet livskraftiga celler kan variera från brunn till brunn efter analysen; Användning av cellantal är att föredra framför andra metoder, inklusive protein- eller DNA-normalisering eftersom protein- eller DNA-innehållet i celler inte förblir konstant under olika förhållanden eller behandlingar för vilka de cellulära energierna jämförs. Protein- eller DNA-halten kan variera under påverkan av olika behandlingar och är en stor nackdel med normalisering med hjälp av denna metod, till exempel förändras proteininnehållet i osteoblast under differentiering. När cellerna mognar under osteoblastogenes börjar de utsöndra extracellulärt matrisprotein vilket ökar det totala cellulära proteininnehållet. Detta kan vara problematiskt när man jämför analysresultaten av celler under olika tillväxtfaser eller tidpunkter för osteoblastogenes.
Med tanke på de många fördelarna har analysatorn för att övervaka cellulär bioenergetik varit ett enormt tillskott för att främja fältet. Det finns dock begränsningar. Till exempel är en av de största begränsningarna för dessa analyser att de endast kan utföras på cellulär eller organoidnivå, och uppgifterna är inte tillräckliga för att ge oss en fullständig uppfattning om vad som skulle hända in vivo under olika fysiologiska förhållanden. Som tidigare nämnts är den cellulära miljön som skapas under analyserna också långt ifrån den ursprungliga fysiologiska nischen. Den konstgjorda mikromiljön som skapas genom att komplettera olika näringsämnen som glukos, pyruvat, glutamin och oljesyra eller palmitinsyra är ofta högre än de normala fysiologiska nivåerna av osteoblasterna. Tillsatsen av fettsyra som ett av näringsämnena för analysen är begränsad, eftersom de flesta fettsyror med högre kolkedjelängd som finns i vår kropp är mycket hydrofoba och mycket olösliga. Detta resulterar i tekniska svårigheter att lägga till dem i analysmediet. Cellernas metaboliska svar på enstaka fettsyror som oljesyra eller palmitinsyra är annorlunda under andra fysiologiska förhållanden, där cellerna upplever en cocktail av olika fettsyror och bindande proteiner. Slutligen förblir mätningen av ATP med denna metod, även om den förmodligen är överlägsen statiska självlysande analyser, indirekt eftersom denna teknik endast mäter syre. Även om det inte är en direkt mätning är det sant att tillsatsen av ATP-syntashämmaren, oligomycin A, följt av elektrontransportkedjehämmare vid mätning av OCR ger starka bevis på förändringar som uppstår i ATP. Därför kan tekniker som massspektroskopi användas för att stödja dessa data. Ändå, medan dessa begränsningar bör övervägas noggrant, ger detta verktyg ovärderlig information om cellulär bioenergetik.
Slutligen noteras att för att förstå hur de nämnda förändringarna i bioenergetik påverkar cellulär funktionalitet, särskilt av BMSC och osteoblaster, behövs kompletterande experiment för att inkluderas in vitro-odling följt av alkaliskt fosfatas (ALIP), Von Kossa eller Alizarin-färgning.
Sammanfattningsvis utgör de ovan beskrivna metoderna grunden för övervakning av olika metaboliska vägar i osteoblaster med hjälp av realtidscellmetabolisk flödesanalysator. Att utföra sådana experiment kommer att leda till en djupare förståelse för hur cellulär bioenergetik i primära, murina BMSC under osteoblastdifferentiering kan moduleras för att förbättra skelettrelaterade resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institute of Health (NIH) National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) Grant AR072123 och National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (till ERR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| 2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid | Sigma - Aldrich | PZ0160 | UK5099 |
| Antimycin A | Sigma - Aldrich | A8674 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544-100G | |
| Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide | Sigma - Aldrich | SML0601 | BPTES |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma - Aldrich | C2920 | FCCP |
| Cytation 5 imaging reader | BioTek | N/A | Microplate imager |
| Etomoxir sodium salt hydrate | Sigma - Aldrich | E1905 | |
| Hoechst 33342 Solution (20 mM) | Thermo Scientific | 62249 | |
| Insulin | Sigma - Aldrich | I6634 | |
| Oleic Acid-Albumin from bovine serum | Sigma - Aldrich | O3008 | |
| Oligomycin A - 5 mg | Sigma - Aldrich | 75351 | |
| Rotenone | Sigma - Aldrich | R8875-1G | |
| Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200mM Glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF DMEM media | Agilent Technologies | 103575-100 | DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent Technologies | S7800B | Real- Time Metabolic flux analyzer |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution |
| The Cell imaging 1.1.0.11 software | Agilent Technologies - BioTek | ||
| Wave software 2.6.1 | Agilent Technologies | ||
| β-glycerol phosphate | Sigma-Aldrich | G9422-50G |
References
- Rodan, G. A.
- Nakahama, K. I. Cellular communications in bone homeostasis and repair. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (23), 4001-4009 (2010).
- Kim, J. M., Lin, C., Stavre, Z., Greenblatt, M. B., Shim, J. H. Osteoblast-osteoclast communication and bone homeostasis. Cells. 9 (9), 2073 (2020).
- Gao, J., et al. SIRT3/SOD2 maintains osteoblast differentiation and bone formation by regulating mitochondrial stress. Cell Death and Differentiation. 25 (2), 229-240 (2018).
- Baron, R. Molecular mechanisms of bone resorption by the osteoclast. The Anatomical Record. 224 (2), 317-324 (1989).
- Tian, L., Rosen, C. J., Guntur, A. R. Mitochondrial Function and Metabolism of Cultured Skeletal Cells. Methods in Molecular Biology. 2230, Clifton, N.J. 437-447 (2021).
- Zanotelli, M. R., et al. Regulation of ATP utilization during metastatic cell migration by collagen architecture. Molecular Biology of the Cell. 29 (1), 1-9 (2018).
- Gonzales, S., Wang, C., Levene, H., Cheung, H. S., Huang, C. Y. C. ATP promotes extracellular matrix biosynthesis of intervertebral disc cells. Cell and Tissue Research. 359 (2), 635-642 (2015).
- Kruse, N. J., Bornstein, P. The metabolic requirements for transcellular movement and secretion of collagen. Journal of Biological Chemistry. 250 (13), 4841-4847 (1975).
- Rendina-Ruedy, E., Guntur, A. R., Rosen, C. J. Intracellular lipid droplets support osteoblast function. Adipocyte. 6 (3), 250-258 (2017).
- Sinnott-Armstrong, N., et al. A regulatory variant at 3q21.1 confers an increased pleiotropic risk for hyperglycemia and altered bone mineral density. Cell Metabolism. 33 (3), 615-628 (2021).
- Esen, E., Lee, S. Y., Wice, B. M., Long, F. PTH promotes bone anabolism by stimulating aerobic glycolysis via IGF signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (11), 1959-1968 (2015).
- Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. Metabolic studies of bone in vitro: I. Normal bone. Journal of Biological Chemistry. 235, 1206-1210 (1960).
- Borle, A. B., Nichols, N., Nichols, G. Metabolic studies of bone in vitro: II. The metabolic patterns of accretion and resorption. Journal of Biological Chemistry. 235, 1211-1214 (1960).
- Adamek, G., Felix, R., Guenther, H. L., Fleisch, H. Fatty acid oxidation in bone tissue and bone cells in culture. Characterization and hormonal influences. The Biochemical Journal. 248 (1), 129-137 (1987).
- Frey, J. L., et al. Wnt-Lrp5 signaling regulates fatty acid metabolism in the osteoblast. Molecular and Cellular Biology. 35 (11), 1979-1991 (2015).
- Romero, N., Rogers, G., Neilson, A., Dranka, B. P. Quantifying cellular ATP production rate using agilent seahorse XF technology. , (2018).
- vander Windt, G., Chang, C., Pearce, E. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse Extracellular Flux Analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1 (2016).
- Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (117), e54918 (2016).
- Noel, P., et al. Preparation and metabolic assay of 3-dimensional spheroid co-cultures of pancreatic cancer cells and fibroblasts. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (126), e56081 (2017).
- Nicholls, D., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), e2511 (2010).
- Sakamuri, S. S. V. P., et al. Measurement of respiratory function in isolated cardiac mitochondria using Seahorse XFe24 Analyzer: applications for aging research. GeroScience. 40 (3), 347-356 (2018).
- What are the advantages of using Seahorse XF technology. , Available from: https://www.agilent.com/en/support/cell-analysis/advantages-of-using-xf-tech (2018).
- Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. O. Review: Quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).
- XF cell energy phenotype test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740884 (2021).
- Leung, D. T. H., Chu, S. Measurement of oxidative stress: Mitochondrial function using the seahorse system. Methods in Molecular Biology. 1710, Clifton, N.J. 285-293 (2018).
- XF ATP rate assay. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740889 (2021).
- XF cell mito stress test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740885 (2021).
- XF cell mito fuel flex test. , Available from: https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-assay-kits-reagents-cell-assay-media/seahorse-xf-cell-energy-phenotype-test-kit-740888 (2021).
- Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors from mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e56750 (2018).
- Wei, J., et al. Glucose uptake and Runx2 synergize to orchestrate osteoblast differentiation and bone formation. Cell. 161 (7), 1576-1591 (2015).
- Zoch, M. L., Abou, D. S., Clemens, T. L., Thorek, D. L. J., Riddle, R. C. In vivo radiometric analysis of glucose uptake and distribution in mouse bone. Bone Research. 4, 16004 (2016).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Methods in Enzymology. 547, 309-354 (2014).
- Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note. , (2017).
