Isoler celletypespecifikke RNA'er fra snapfrosne heterogene vævsprøver uden cellesortering
Summary
Denne protokol sigter mod at isolere celletypespecifik oversættelse af ribosomale mRNA’er ved hjælp af NuTRAP-musemodellen.
Abstract
Cellulær heterogenitet udgør udfordringer for at forstå funktionen af komplekse væv på et transkriptomniveau. Brug af celletypespecifikke RNA’er undgår potentielle faldgruber forårsaget af vævets heterogenitet og frigør den kraftfulde transkriptomanalyse. Protokollen, der er beskrevet her, viser, hvordan man bruger TRAP-metoden (Translating Ribosome Affinity Purification) til at isolere ribosombundne RNA’er fra en lille mængde EGFP-ekspressive celler i et komplekst væv uden cellesortering. Denne protokol er velegnet til isolering af celletypespecifikke RNA’er ved hjælp af den nyligt tilgængelige NuTRAP-musemodel og kan også bruges til at isolere RNA’er fra alle EGFP-ekspressive celler.
Introduction
High-throughput tilgange, herunder RNA-sekventering (RNA-seq) og microarray, har gjort det muligt at forhøre genekspressionsprofiler på genom-dækkende niveau. For komplekse væv som hjerte, hjerne og testikelser vil de celletypespecifikke data give flere detaljer, der sammenligner brugen af RNA’er fra hele vævet 1,2,3. For at overvinde virkningen af cellulær heterogenitet er metoden Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) blevet udviklet siden begyndelsen af 2010’erne4. TRAP er i stand til at isolere ribosombundne RNA’er fra specifikke celletyper uden vævsdissociation. Denne metode er blevet brugt til translatom (mRNA’er, der rekrutteres til ribosomet til translation) analyse i forskellige organismer, herunder målretning mod en ekstremt sjælden population af muskelceller i Drosophila embryoner5, undersøgelse af forskellige rodceller i modelplanten Arabidopsis thaliana6 og udførelse af transkriptomanalyse af endotelceller hos pattedyr7.
TRAP kræver en genetisk modifikation for at mærke ribosomet af en modelorganisme. Evan Rosen og kolleger udviklede for nylig en musemodel kaldet Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mus8, som har været tilgængelig via Jackson Laboratory siden 2017. Ved at krydse med en Cre-muselinje kan forskere bruge denne NuTRAP-musemodel til at isolere ribosombundne RNA’er og cellekerner fra Cre-ekspressive celler uden cellesortering. I Cre-ekspressive celler, der også bærer NuTRAP-allelen , tillader EGFP / L10a-mærket ribosomet isolering af oversættelse af mRNA’er ved hjælp af affinitetspulldown-assays. Ved samme celle tillader biotin ligasegenkendelsespeptid (BLRP) -mærket nuklear membran, som også er mCherry-positiv, den nukleare isolering ved hjælp af affinitets- eller fluorescensbaseret oprensning. Det samme forskerhold genererede også en lignende muselinje, hvor kernemembranen kun er mærket med mCherry uden biotin8. Disse to genetisk modificerede muselinjer giver adgang til at karakterisere parrede epigenomiske og transkriptomiske profiler af specifikke typer celler i interesse.
Pindsvinets (Hh) signalvej spiller en afgørende rolle i vævsudvikling9. GLI1, et medlem af GLI-familien, fungerer som en transkriptionel aktivator og formidler Hh-signalering. Gli1+ celler findes i mange hormonudskillende organer, herunder binyrerne og testiklerne. For at isolere celletypespecifikke DNA’er og RNA’er fra Gli1+ celler ved hjælp af NuTRAP-musemodellen blev Gli1-CreERT2-mus krydset med NuTRAP-musene. Shh-CreERT2-mus blev også krydset med NuTRAP-musenes mål om at isolere sonisk pindsvin (Shh) ekspressive celler. Følgende protokol viser, hvordan du bruger Gli1-CreERT2; NuTRAP-mus til at isolere ribosombundne RNA’er fra Gli1+ celler i voksne musetestikler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nytten af helvævstranskriptomanalysen kan dæmpes, især når man studerer komplekse heterogene væv. Hvordan man får celletypespecifikke RNA’er bliver et presserende behov for at frigøre den kraftfulde RNA-seq-teknik. Isoleringen af celletypespecifikke RNA’er er normalt afhængig af indsamling af en bestemt type celler ved hjælp af mikromanipulation, fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) eller laserfangstmikrodissektion (LCM)18. Andre moderne enkeltcelleopsamlingsmetoder og instrumen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH R00HD082686. Vi takker Endocrine Society Summer Research Fellowship til HSZ. Vi takker også Dr. Yuan Kang for opdræt og vedligeholdelse af musekolonien.
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
References
- Yang, K. C., et al. Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support. Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).
- Soumillon, M., et al. Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis. Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).
- Lake, B. B., et al. Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain. Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).
- Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP). Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).
- Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985 (2015).
- Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919 (2020).
- Moran, P., et al. Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624 (2019).
- Roh, H. C., et al. Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo. Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).
- Varjosalo, M., Taipale, J. Hedgehog: functions and mechanisms. Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).
- Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control. Agilent Technologies. , 1-8 (2004).
- Lyu, Q., et al. RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone. Endocrinology. 161 (9), (2020).
- King, P., Paul, A., Laufer, E. Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).
- Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog. Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).
- Benton, L., Shan, L. -. X., Hardy, M. P. Differentiation of adult Leydig cells. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).
- Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids. Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).
- Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline. Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).
- Beverdam, A., et al. Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice. Reproduction. 137 (3), 481 (2009).
- Gross, A., et al. Technologies for single-cell isolation. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches. Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108 (2018).
- Chucair-Elliott, A. J., et al. Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia. Communications Biology. 3 (1), 693 (2020).
- Barsoum, I., Yao, H. H. Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells. Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).
- Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice. The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).
