Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire
Summary
Ce protocole vise à isoler les ARNm ribosomales de traduction spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP.
Abstract
L’hétérogénéité cellulaire pose des défis pour comprendre la fonction des tissus complexes au niveau du transcriptome. L’utilisation d’ARN spécifiques au type cellulaire évite les pièges potentiels causés par l’hétérogénéité des tissus et libère la puissante analyse du transcriptome. Le protocole décrit ici montre comment utiliser la méthode TRAP (Translating Ribosome Affinity Purity) pour isoler les ARN liés aux ribosomes à partir d’une petite quantité de cellules exprimant l’EGFP dans un tissu complexe sans tri cellulaire. Ce protocole convient à l’isolement d’ARN spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP récemment disponible et pourrait également être utilisé pour isoler les ARN de toutes les cellules exprimant l’EGFP.
Introduction
Les approches à haut débit, y compris le séquençage de l’ARN (RNA-seq) et les microarrays, ont permis d’interroger les profils d’expression génique à l’échelle du génome. Pour les tissus complexes tels que le cœur, le cerveau et les testicules, les données spécifiques au type cellulaire fourniront plus de détails comparant l’utilisation des ARN du tissu entier 1,2,3. Pour surmonter l’impact de l’hétérogénéité cellulaire, la méthode TRAP (Translating Ribosome Affinity Purifie) est développée depuis le début des années 20104. TRAP est capable d’isoler les ARN liés aux ribosomes de types cellulaires spécifiques sans dissociation tissulaire. Cette méthode a été utilisée pour l’analyse des translatomes (ARNm qui sont recrutés sur le ribosome pour la traduction) dans différents organismes, y compris le ciblage d’une population extrêmement rare de cellules musculaires chez les embryons de drosophile5, l’étude de différentes cellules racinaires dans la plante modèle Arabidopsis thaliana6 et l’analyse du transcriptome des cellules endothéliales chez les mammifères7.
TRAP nécessite une modification génétique pour marquer le ribosome d’un organisme modèle. Evan Rosen et ses collègues ont récemment développé un modèle murin appelé Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse 8, disponible auprès du Jackson Laboratory depuis 2017. En croisant avec une lignée de souris Cre, les chercheurs peuvent utiliser ce modèle murin NuTRAP pour isoler les ARN liés aux ribosomes et les noyaux cellulaires des cellules exprimant Cre sans tri cellulaire. Dans les cellules exprimant Cre qui portent également l’allèle NuTRAP , le ribosome marqué EGFP/L10a permet l’isolement des ARNm transposés à l’aide de tests d’affinité. Dans la même cellule, la membrane nucléaire marquée au peptide de reconnaissance de la biotine ligase (BLRP), qui est également positive à la cerise, permet l’isolement nucléaire en utilisant une purification basée sur l’affinité ou la fluorescence. La même équipe de recherche a également généré une lignée de souris similaire dans laquelle la membrane nucléaire est marquée uniquement avec mCherry sans biotine8. Ces deux lignées de souris génétiquement modifiées donnent accès à la caractérisation des profils épigénomiques et transcriptomiques appariés de types spécifiques de cellules d’intérêt.
La voie de signalisation du hérisson (Hh) joue un rôle essentiel dans le développement des tissus9. GLI1, un membre de la famille GLI, agit comme un activateur transcriptionnel et médie la signalisation Hh. Les cellules Gli1+ peuvent être trouvées dans de nombreux organes sécrétant des hormones, y compris la glande surrénale et le testicule. Pour isoler les ADN et les ARN spécifiques du type cellulaire des cellules Gli1+ à l’aide du modèle murin NuTRAP, des souris Gli1-CreERT2 ont été croisées avec les souris NuTRAP . Des souris Shh-CreERT2 ont également été croisées avec les souris NuTRAP visant à isoler les cellules exprimant sonic hedgehog (Shh). Le protocole suivant montre comment utiliser Gli1-CreERT2; Des souris NuTRAP pour isoler les ARN liés aux ribosomes à partir de cellules Gli1+ dans des testicules de souris adultes.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilité de l’analyse du transcriptome des tissus entiers pourrait être atténuée, en particulier lors de l’étude de tissus hétérogènes complexes. Comment obtenir des ARN spécifiques au type cellulaire devient un besoin urgent de libérer la puissante technique de séquençage de l’ARN. L’isolement d’ARN spécifiques à un type cellulaire repose généralement sur la collecte d’un type spécifique de cellules à l’aide de la micromanipulation, du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été partiellement soutenu par NIH R00HD082686. Nous remercions la bourse de recherche d’été de l’Endocrine Society à H.S.Z. Nous remercions également le Dr Yuan Kang pour la reproduction et le maintien de la colonie de souris.
Materials
| Actb | eurofins | qPCR primers | ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT (forward primer/reverse primer) |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 Bioanalyzer Instrument | |
| cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore | 11836170001 | |
| cycloheximide | Millipore | 239764-100MG | |
| Cyp11a1 | eurofins | qPCR primers | CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (forward primer/reverse primer) |
| dNTP | Thermo Fisher Scientific | R0191 | |
| DTT, Dithiothreitol | Thermo Fisher Scientific | P2325 | |
| DynaMag-2 magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | |
| Falcon tubes 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| GFP antibody | Abcam | ab290 | |
| Glass grinder set | DWK Life Sciences | 357542 | |
| heparin | BEANTOWN CHEMICAL | 139975-250MG | |
| Hsd3b | eurofins | qPCR primers | GACAGGAGCAGGAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (forward primer/reverse primer) |
| KCl | Biosciences | R005 | |
| MgCl2 | Biosciences | R004 | |
| Microcentrifuge tubes 2 mL | Thermo Fisher Scientific | 02-707-354 | |
| Mouse Clariom S Assay microarrays | Thermo Fisher Scientific | Microarray service | |
| NP-40 | Millipore | 492018-50 Ml | |
| oligo (dT)20 | Invitrogen | 18418020 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | KIT0204 | |
| Protein G Dynabead | Thermo Fisher Scientific | 10003D | |
| RNase-free water | growcells | NUPW-0500 | |
| RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 10777019 | |
| Sox9 | eurofins | qPCR primers | TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (forward primer/reverse primer |
| Superscript IV reverse transcriptase | Invitrogen | 18090050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | |
| Sycp3 | eurofins | qPCR primers | GAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (forward primer/reverse primer) |
| Tris | Alfa Aesar | J62848 |
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