CD-spektroskopi til undersøgelse af DNA-proteininteraktioner

Summary

Samspillet mellem en ATP-afhængig kromatin remodeler med en DNA ligand er beskrevet ved hjælp af CD spektroskopi. De inducerede kropsbygningsændringer på en genpromotor analyseret af de genererede toppe kan bruges til at forstå mekanismen for transskriptionel regulering.

Abstract

Cirkulær dichroisme (CD) spektroskopi er en enkel og bekvem metode til at undersøge biomolekylernes sekundære struktur og interaktioner. Nylige fremskridt inden for CD-spektroskopi har gjort det muligt at studere DNA-proteininteraktioner og dna-overensstemmelsesdynamik i forskellige mikromiljø i detaljer for en bedre forståelse af transskriptionel regulering in vivo. Området omkring en potentiel transskriptionszone skal rulles ud, for at transskription kan forekomme. Dette er en kompleks proces, der kræver koordinering af histone modifikationer, binding af transskriptionsfaktoren til DNA og andre kromatin remodeling aktiviteter. Ved hjælp af CD-spektroskopi er det muligt at studere kropsbygningsændringer i promotorregionen forårsaget af regulatoriske proteiner, såsom ATP-afhængige kromatin remodelers, for at fremme transskription. De kropslige ændringer, der forekommer i proteinet, kan også overvåges. Derudover kan forespørgsler vedrørende proteinets affinitet mod dets mål-DNA og sekvensspecifikitet behandles ved at indarbejde mutationer i mål-DNA’et. Kort sagt kan den unikke forståelse af denne følsomme og billige metode forudsige ændringer i kromatindynamikken og derved forbedre forståelsen af transskriptionsregulering.

Introduction

Cirkulær dichroisme (CD) er en spektroskopisk teknik, der bygger på den iboende chiralitet af biologiske makromolekyler, der fører til differentialabsorption af højrehåndet og venstrehåndet cirkulært polariseret lys. Denne differentialabsorption er kendt som cirkulær dichroisme. Teknikken kan derfor bruges til at afgrænse kropsbygning af biologiske makromolekyler, såsom proteiner og DNA, som begge indeholder chiral ^centre1,2.

Elektromagnetiske bølger indeholder både elektriske og magnetiske komponenter. Både de elektriske og de magnetiske felter svinger vinkelret på retningen af bølgeudbredelse. I tilfælde af upolariseret lys svinger disse felter i mange retninger. Når lyset er cirkulært polariseret, opnås to elektromagnetiske felter ved 90 ° faseforskel til hinanden. Chiralmolekyler viser cirkulær optisk rotation (birefringence), således at de vil absorbere det højrehåndede cirkulært polariserede lys og det venstrehåndede cirkulært polariserede lys i forskellige ^omfang3. Det resulterende elektriske felt vil blive sporet som en ellipse, en funktion af bølgelængden. Cd-spektret registreres således som elliptiskhed (q), og dataene præsenteres som Mean Rest Ellipticity som en funktion af bølgelængde.

For proteiners vedkommende er Cα af aminosyrer (undtagen glycin) chiral, og dette udnyttes ved cd-spektroskopi til at bestemme den sekundære struktur af denne ^{makromolekyle4}. Cd-spektret af proteinmolekyler registreres typisk i Langt UV-området. α-spiralformede proteiner har to negative bånd ved 222 nm og 208 nm og en positiv top ved 193 ^nm4. Proteiner med anti-parallel β-arks sekundær struktur viser en negativ top på 218 nm og en positiv top ved 195 ^nm4. Proteiner med uordnede strukturer viser lav elliptiskhed nær 210 nm og en negativ top ved 195 ^nm4. Således gør de veldefinerede spidsbelastninger/bånd til forskellige sekundære strukturer CD til et praktisk værktøj til at belyse de kropslige ændringer, der forekommer i proteinernes sekundære struktur under denaturering samt ligandbinding.

Nukleinsyrer har tre kilder til chiralitet: sukkermolekylet, den sekundære strukturs heliktighed og den langtrækkende tertiære bestilling af DNA i ^miljøet5,6. Cd-spektret af nukleinsyrer registreres typisk i intervallet 190 til 300 ^nm5,6. Hver kropsbygning af DNA, ligesom proteiner, giver et karakteristisk spektrum, selv om toppe / bånd kan variere med nogle grader på grund af opløsningsmiddel betingelser og forskelle i DNA-sekvenser7. B-DNA, den mest almindelige form, er karakteriseret ved en positiv top omkring 260-280 nm og en negativ top omkring 245 ^nm6. Tinder/bånd af B-form DNA er generelt små, fordi baseparret er vinkelret på dobbelthelixen, hvilket giver molekylet svag chiralitet. A-DNA giver et dominerende positivt højdepunkt på 260 nm og en negativ top omkring 210 ^nm6. Z-DNA, den venstrehåndede helix, giver et negativt bånd på 290 nm og en positiv top omkring 260 ^nm6. Dette DNA giver også en ekstremt negativ top ved 205 ^nm6.

Ud over disse konformationer kan DNA også danne triplexer, quadruplexes og hårnåle, som alle kan skelnes af CD-spektroskopi. Den parallelle G-quadruplex giver et dominerende positivt bånd på 260 nm, mens den anti-parallelle G-quadruplex giver et negativt bånd på 260 nm og en positiv top på 290 nm, hvilket gør det nemt at skelne mellem de to former for quadruplex ^strukturer6. Triplexes giver ikke et karakteristisk ^spektrum8. For eksempel viser spektret af et 36 nukleotidlangt DNA med potentiale til at danne et intramoleklekkulært tredobbelt helix indeholdende G.G.C og T.A.T-basepar i nærværelse af Na⁺ et stærkt negativt bånd ved 240 nm og en bred positiv top. Den brede positive top viser bidrag på 266, 273 og 286 nm. Den samme oligonuleotid i nærværelse af Na⁺ og Zn⁺ viser fire negative bånd (213, 238, 266 og 282 nm) og en positiv top på 258 nm. Således kan spektret af triplex DNA variere afhængigt af ^saltforhold8.

Ud over disse konformationer har CD-spektre gjort det muligt at identificere en anden form for DNA kaldet X-DNA. X-DNA dannes, når DNA-sekvensen indeholder alternative adenin- og thyminrester. Cd-spektret af X-DNA indeholder to negative toppe ved 250 og 280 nm. Meget lidt information er tilgængelig om X-DNA, selv om det er blevet spekuleret til at fungere som en vask for positiv supercoiling6,9. Ændringer i CD spektre kan også afsløre detaljer om ligand-protein interaktioner og derfor er blevet tilføjet til arsenal af molekylære metoder til påvisning af lægemiddel-protein interaktioner10,11,12,13,14. CD spektre er også blevet brugt til at overvåge ændringerne i den sekundære struktur af proteiner under ^{foldeprocessen15}. Tilsvarende cd-spektre kan også bruges til sondering ligand-DNA ^{interaktioner16,17}.

Cd-spektroskopi er således en nem og billig metode til at skelne mellem de forskellige former for DNA-kropsbygning, forudsat at der er adgang til ikke-så-billigt udstyr og software. Metoden er yderst følsom og hurtig. Det kræver kun en lille mængde DNA, hvilket giver det en kant over den alternative teknik med nuklear magnetisk resonans (NMR) spektroskopi. Titreringer med ligands og substrater er også nemme at udføre. Den største begrænsning er, at DNA’et skal være meget rent. Det er tilrådeligt at bruge polyacrylamidgelelektroforese (PAGE)-renset DNA.

De oplysninger, der er indhentet af CD-spektre, er hovedsagelig blevet brugt til at udlede protein strukturelle træk og til at identificere forskellige DNA-konforme. I denne undersøgelse er CD-spektre blevet brugt til at integrere resultaterne fra et in vivo Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) eksperiment for at afgrænse, om proteinet af interesse / forudsagt transskription faktor kan medføre en kropsbygningsændring i promotorregionen af dets effektor gener. Dette samarbejde hjælper med udviklingen af traditionelle CD-spektroskopiske teknikker ved at forudsige mekanismen for transskription regulering af den forudsagte transskription faktor på og omkring transskription start site (TSS) af en promotor.

Chromatin remodeling er en veldefineret mekanisme kendt for at regulere DNA metaboliske processer ved at gøre tæt pakket kromatin tilgængelig for forskellige lovgivningsmæssige faktorer såsom transskription faktorer, komponenter af DNA-replikation, eller skade reparation proteiner. De ATP-afhængige kromatin remodelers, også kendt som SWI / SNF familie af proteiner, er centrale remodeler proteiner til stede i eukaryote ^celler18,19. Phylogenetisk klyngedannelse har kategoriseret SWI / SNF-familien af proteiner i 6 ^{undergrupper20}: Snf2-lignende, Swr1-lignende, SSO1653-lignende, Rad54-lignende, Rad5/16-lignende og fjern. SMARCAL1, proteinet af interesse i denne undersøgelse, tilhører den fjerne ^{undergruppe20}. Dette protein er blevet brugt til at undersøge dets form for transskriptionel regulering ved hjælp af CD-spektroskopi.

De fleste af medlemmerne af atp-afhængige kromatin remodeling proteiner har vist sig at enten flytte eller smide nukleosomer eller mægle histone variant udveksling i en ATP-afhængige ^måde21,22. Nogle medlemmer af denne familie har imidlertid ikke vist sig at ombygge nukleosomer, f.eks. Selv om undersøgelser har vist, at SMARCAL1 forbinder med polyten kromosomer, eksperimentelle beviser vedrørende dens evne til at ombygge nukleosomer ^mangler23. Derfor blev det postuleret, at SMARCAL1 kan regulere transskription ved at ændre kropsbygning af ^DNA24. CD-spektroskopi gav en nem og tilgængelig metode til at validere denne hypotese.

SMARCAL1 er et ATP-afhængig kromatin remodeling protein, der primært fungerer som en udglødende helicase25,26,27. Det er blevet postuleret at modulere transskription ved at ombygge ^{DNA-kropsbygning24}. For at teste denne hypotese blev SMARCAL1’s rolle i reguleringen af gentransskription under doxorubicin-induceret DNA-skade undersøgt. I disse undersøgelser blev SMARCAL1 anvendt til in vivoanalyse og ADAAD til in vitro-analyser28,29. Tidligere undersøgelser har vist, at ADAAD kan genkende DNA på en strukturafhængig, men sekvensafhængig ^måde30,31. Proteinet binder sig optimalt til DNA-molekyler, der besidder dobbeltstrengede til enkeltstrengede overgangsregioner, svarende til stem-loop DNA, og hydrolyser ATP ^30,31.

In vivo-eksperimenter viste, at SMARCAL1 regulerer myc’s, DROSHA’s, DGCR8’s og DICER’s udtryk ved at binde sig til initiativregionerne28,29. Interaktionsområdet blev identificeret ved ChIP-eksperimenter28,29. ChIP-teknikken bruges til at analysere samspillet mellem et protein og dets cognate DNA i cellen. Dens mål er at afgøre, om specifikke proteiner, såsom transskriptionsfaktorer på initiativtagere eller andre DNA-bindingssteder, er bundet til specifikke genomiske områder. Proteinet bundet til DNA er først krydsbundet ved hjælp af formaldehyd. Dette efterfølges af isolering af kromatin. Den isolerede kromatin er forskåret til 500 bp fragmenter enten ved sonikering eller nuklease fordøjelse, og proteinet bundet til DNA er immunprecipiteret ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for proteinet. Krydskædning er vendt, og DNA analyseres ved hjælp af enten polymerase kædereaktion (PCR) eller kvantitativ real-time PCR.

ChIP-resultaterne førte til hypotesen om, at SMARCAL1 muligvis formidler transskriptionel regulering ved at fremkalde en kropsbygningsændring i promotorregionerne af disse gener. QGRS-mapper og Mfold-software blev brugt til at identificere disse promotorregioners potentiale til at danne sekundære ^{strukturer28,29}. QGRS mapper bruges til at forudsige G-quadruplexes32, mens ^Mfold33 analyserer en sekvenss evne til at danne sekundære strukturer som stem-loops.

Efter sekundær strukturanalyse blev der udført yderligere in vitro-eksperimenter med rekombinant 6X His-tagged Active DNA-afhængige ATPase A Domain (ADAAD), kvæg homolog af SMARCAL1, renset fra Escherichia coli34. ATPase-analyser blev udført ved hjælp af ADAAD for at fastslå, at de identificerede DNA-sekvenser kunne fungere som ^{effektorer28,29}. Endelig blev cd-spektroskopi udført for at overvåge de kropslige ændringer, der blev induceret i DNA-molekylet af ^ADAAD28,29.

For at bevise, at proteinets ATPase-aktivitet var afgørende for at fremkalde en kropsbygningsændring i DNA-molekylet, blev der tilsat enten ethylendiamin tetraacesyre (EDTA) for at chelatere Mg⁺² eller Active DNA-afhængige ATPase A Domain Inhibitor Neomycin (ADAADiN), en specifik hæmmer af SWI/SNF-proteinet, tilsat35,36 . Denne CD spektroskopiske teknik kan anvendes med ethvert renset protein, der er blevet påvist af ChIP eller enhver anden relevant analyse til at binde sig til en forudsagt genomisk region af en promotor.

Protocol

1. Arbejdskoncentration af reaktionskomponenterne Arbejdskoncentrationerne af buffere til cd’er og andre reaktionskomponenter er frisklavet (se tabel 1), og hold dem på 4 °C, før reaktionerne opsættes.BEMÆRK: For de cd-reaktioner, der er beskrevet i dette papir, er arbejdskoncentrationerne af komponenter som følger: Natriumphosphatbuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM. <p class="jove_titl…

Representative Results

ADAAD stabiliserer en stilk-loop lignende struktur på MYC promotorTidligere eksperimentelle beviser viste, at SMARCAL1 er en negativ regulator af MYC29. En analyse af den 159 bp lange promotorregion af MYC-genet af QGRS-mapper viste, at den forreste streng havde potentiale til at danne en G-quadruplex (tabel 2). Mfold viste, at begge dele af MYC DNA kunne danne en stilk-loop-lignende strukt…

Discussion

Formålet med denne artikel er at introducere CD-spektroskopiteknikken som en metode til at studere de kropslige ændringer, der forekommer i DNA’et i nærværelse af ATP-afhængige kromatin-remodelingproteiner, og at knytte disse kropslige ændringer til genekspression. CD-spektroskopi giver en hurtig og let tilgængelig metode til at studere de kropslige ændringer i DNA.

Et afgørende punkt, der skal overvejes for denne teknik, er renheden af DNA og protein. Det er tilrådeligt at s…

Materials

2-Mercaptoethanol	Fisher scientific	O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigmaaldrich	A2383
CD Quartz Cuvette	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer	Applied Photophysics	Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate	SRL	43272
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01	Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution	Hellma	9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase	Sigmaaldrich	L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher scientific	BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher scientific	M33-500
NADH disodium salt	Sigmaaldrich	10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt	SRL	40083
Potassium Acetate	Fisher scientific	P178-3
Pyruvate Kinase	Sigmaaldrich	P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher scientific	S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT microplate reader	BioTek	Not available
Tris Base	Fisher scientific	BP152-500