CD-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen

Summary

Die Wechselwirkung eines ATP-abhängigen Chromatin-Remodelers mit einem DNA-Liganden wird mittels CD-Spektroskopie beschrieben. Die induzierten Konformationsänderungen an einem Genpromotor, die durch die erzeugten Peaks analysiert werden, können verwendet werden, um den Mechanismus der transkriptionellen Regulation zu verstehen.

Abstract

Die zirkuläre Dichroismusspektroskopie (CD) ist eine einfache und bequeme Methode, um die Sekundärstruktur und Wechselwirkungen von Biomolekülen zu untersuchen. Jüngste Fortschritte in der CD-Spektroskopie haben es ermöglicht, DNA-Protein-Interaktionen und die Konformationsdynamik von DNA in verschiedenen Mikroumgebungen im Detail zu untersuchen, um die Transkriptionsregulation in vivo besser zu verstehen. Der Bereich um eine potenzielle Transkriptionszone muss abgewickelt werden, damit eine Transkription stattfinden kann. Dies ist ein komplexer Prozess, der die Koordination von Histonmodifikationen, die Bindung des Transkriptionsfaktors an DNA und andere Chromatin-Remodeling-Aktivitäten erfordert. Mit Hilfe der CD-Spektroskopie ist es möglich, Konformationsänderungen in der Promotorregion zu untersuchen, die durch regulatorische Proteine wie ATP-abhängige Chromatin-Remodeler verursacht werden, um die Transkription zu fördern. Die im Protein auftretenden Konformationsänderungen können ebenfalls überwacht werden. Darüber hinaus können Fragen zur Affinität des Proteins zu seiner Ziel-DNA und sequenziellen Spezifität durch die Integration von Mutationen in die Ziel-DNA beantwortet werden. Kurz gesagt, das einzigartige Verständnis dieser empfindlichen und kostengünstigen Methode kann Änderungen der Chromatindynamik vorhersagen und dadurch das Verständnis der transkriptionellen Regulation verbessern.

Introduction

Zirkulardichroismus (CD) ist eine spektroskopische Technik, die auf der inhärenten Chiralität biologischer Makromoleküle beruht, die zu einer differentiellen Absorption von rechts- und linkshändig zirkular polarisiertem Licht führt. Diese differentielle Absorption wird als zirkulärer Dichroismus bezeichnet. Die Technik kann daher verwendet werden, um die Konformation von biologischen Makromolekülen wie Proteinen und DNA abzugrenzen, die beide chirale Zentren ^enthalten1,2.

Elektromagnetische Wellen enthalten sowohl elektrische als auch magnetische Komponenten. Sowohl das elektrische als auch das magnetische Feld schwingen senkrecht zur Ausbreitungsrichtung der Welle. Bei unpolarisiertem Licht schwingen diese Felder in viele Richtungen. Wenn das Licht zirkular polarisiert ist, werden zwei elektromagnetische Felder bei 90° Phasendifferenz zueinander erhalten. Chirale Moleküle zeigen eine kreisförmige optische Rotation (Doppelbrechung), so dass sie das rechtshändig zirkular polarisierte Licht und das linkshändige zirkular polarisierte Licht in unterschiedlichem Maße ^absorbieren3. Das resultierende elektrische Feld wird als Ellipse, eine Funktion der Wellenlänge, nachgezeichnet. Das CD-Spektrum wird somit als Elliptizität (q) aufgezeichnet, und die Daten werden als mittlere Rückstandsellipizität als Funktion der Wellenlänge dargestellt.

Im Falle von Proteinen ist das Cα von Aminosäuren (außer Glycin) chiral, und dies wird von der CD-Spektroskopie ausgenutzt, um die Sekundärstruktur dieses Makromoleküls zu ^bestimmen4. Die CD-Spektren von Proteinmolekülen werden typischerweise im Fernen UV-Bereich aufgezeichnet. α-helikale Proteine haben zwei negative Banden bei 222 nm und 208 nm und einen positiven Peak bei 193 ^nm4. Proteine mit antiparalleler β-Sheet-Sekundärstruktur zeigen einen negativen Peak bei 218 nm und einen positiven Peak bei 195 ^nm4. Proteine mit ungeordneten Strukturen zeigen eine geringe Elliptik in der Nähe von 210 nm und einen negativen Peak bei 195 ^nm4. So machen die wohldefinierten Peak/Banden für verschiedene Sekundärstrukturen CD zu einem bequemen Werkzeug, um die Konformationsänderungen in der Sekundärstruktur der Proteine während der Denaturierung sowie der Ligandenbindung aufzuklären.

Nukleinsäuren haben drei Quellen der Chiralität: das Zuckermolekül, die Helizität der Sekundärstruktur und die langreichweitige tertiäre Ordnung der DNA in der ^Umwelt5,6. Die CD-Spektren von Nukleinsäuren werden typischerweise im Bereich von 190 bis 300 nm ^{aufgezeichnet5,6}. Jede Konformation der DNA, genau wie Proteine, ergibt ein charakteristisches Spektrum, obwohl die Peaks / Banden aufgrund von Lösungsmittelbedingungen und Unterschieden in den DNA-Sequenzen um einige Grade variieren ^können7. B-DNA, die häufigste Form, ist durch einen positiven Peak um 260-280 nm und einen negativen Peak um 245 ^nm6 gekennzeichnet. Die Peaks / Banden der B-Form-DNA sind im Allgemeinen klein, da die Basenpaare senkrecht zur Doppelhelix stehen, was dem Molekül eine schwache Chiralität verleiht. A-DNA ergibt einen dominanten positiven Peak bei 260 nm und einen negativen Peak um 210 ^nm6. Z-DNA, die linkshändige Helix, ergibt ein negatives Band bei 290 nm und einen positiven Peak um 260 ^nm6. Diese DNA ergibt auch einen extrem negativen Peak bei 205 ^nm6.

Zusätzlich zu diesen Konformationen kann DNA auch Triplexe, Quadruplexe und Haarnadelkurven bilden, die alle durch CD-Spektroskopie unterschieden werden können. Der parallele G-Quadruplex ergibt ein dominantes positives Band bei 260 nm, während der antiparallele G-Quadruplex ein negatives Band bei 260 nm und einen positiven Peak bei 290 nm ergibt, was es leicht macht, zwischen den beiden Formen von Quadruplexstrukturen zu ^{unterscheiden6}. Triplexe ergeben kein charakteristisches ^Spektrum8. Zum Beispiel zeigen die Spektren einer 36 Nukleotid-langen DNA mit dem Potenzial, eine intramolekulare Dreifachhelix zu bilden, die G.G.C und T.A.T-Basenpaare in Gegenwart von Na ⁺ enthält, eine starke negative Bande bei 240 nm und einen breiten positiven Peak. Der breite positive Peak zeigt Beiträge bei 266, 273 und 286 nm. Das gleiche Oligonukleotid in Gegenwart von Na⁺ und Zn⁺ zeigt vier negative Banden (213, 238, 266 und 282 nm) und einen positiven Peak bei 258 nm. Daher können die Spektren der Triplex-DNA je nach Salzbedingungen ^variieren8.

Zusätzlich zu diesen Konformationen haben CD-Spektren die Identifizierung einer anderen Form von DNA namens X-DNA ermöglicht. X-DNA entsteht, wenn die DNA-Sequenz alternative Adenin- und Thyminreste enthält. Die CD-Spektren der X-DNA enthalten zwei negative Peaks bei 250 und 280 nm. Über X-DNA liegen nur sehr wenige Informationen vor, obwohl spekuliert wurde, dass sie als Senke für positive Supercoiling ^fungiert6,9. Veränderungen in CD-Spektren können auch Details über Liganden-Protein-Wechselwirkungen offenbaren und wurden daher dem Arsenal molekularer Methoden zum Nachweis von Arzneimittel-Protein-Wechselwirkungen hinzugefügt10,11,12,13,14. CD-Spektren wurden auch verwendet, um die Veränderungen in der Sekundärstruktur von Proteinen während des Faltungsprozesses zu ^{überwachen15}. In ähnlicher Weise können CD-Spektren auch zur Untersuchung von Liganden-DNA-Interaktionen verwendet ^werden16,17.

Die CD-Spektroskopie ist daher eine einfache, kostengünstige Methode, um zwischen den verschiedenen Formen der DNA-Konformation zu unterscheiden, vorausgesetzt, es besteht Zugang zu nicht so kostengünstigen Geräten und Software. Die Methode ist äußerst empfindlich und schnell. Es benötigt nur eine kleine Menge an DNA, was ihm einen Vorteil gegenüber der alternativen Technik der Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) verschafft. Titrationen mit Liganden und Substraten sind ebenfalls einfach durchzuführen. Die Haupteinschränkung ist, dass die DNA hochrein sein sollte. Es ist ratsam, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) gereinigte DNA zu verwenden.

Die durch CD-Spektren gewonnenen Informationen wurden hauptsächlich verwendet, um Proteinstrukturmerkmale abzuleiten und verschiedene DNA-Konformere zu identifizieren. In dieser Studie wurden CD-Spektren verwendet, um die Ergebnisse eines In-vivo-Experiments zur Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) zu integrieren, um zu beschreiben, ob das interessierende Protein / der vorhergesagte Transkriptionsfaktor eine Konformationsänderung in der Promotorregion seiner Effektorgene bewirken kann. Diese Zusammenarbeit unterstützt den Fortschritt traditioneller CD-spektroskopischer Techniken, indem sie den Mechanismus der Transkriptionsregulation durch den vorhergesagten Transkriptionsfaktor auf und um die Transkriptionsstartstelle (TSS) eines Promotors vorhersagt.

Chromatin-Remodeling ist ein klar definierter Mechanismus, der dafür bekannt ist, DNA-Stoffwechselprozesse zu regulieren, indem er das dicht gepackte Chromatin für verschiedene regulatorische Faktoren wie Transkriptionsfaktoren, Komponenten der DNA-Replikation oder Schadensreparaturproteine zugänglich macht. Die ATP-abhängigen Chromatin-Remodeler, auch bekannt als die SWI/SNF-Familie von Proteinen, sind wichtige Remodeler-Proteine, die in eukaryotischen Zellen ^{vorkommen18,19}. Die phylogenetische Clusterbildung hat die SWI/SNF-Familie von Proteinen in 6 Untergruppen ^eingeteilt20: Snf2-ähnlich, Swr1-ähnlich, SSO1653-ähnlich, Rad54-ähnlich, Rad5/16-ähnlich und entfernt. SMARCAL1, das protein von Interesse in dieser Studie, gehört zur entfernten ^{Untergruppe20}. Dieses Protein wurde verwendet, um seine Art der transkriptionellen Regulation mittels CD-Spektroskopie zu untersuchen.

Es wurde gezeigt, dass die meisten Mitglieder der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Proteine entweder Nukleosomen neu positionieren oder vertreiben oder den Austausch von Histonvarianten atP-abhängig ^{vermitteln21,22}. Es wurde jedoch nicht gezeigt, dass einige Mitglieder dieser Familie Nukleosomen umgestalten, z. B. SMARCAL1. Obwohl Studien gezeigt haben, dass SMARCAL1 mit Polyten-Chromosomen assoziiert ist, fehlen experimentelle Beweise für seine Fähigkeit, Nukleosomen ^{umzugestalten23}. Daher wurde postuliert, dass SMARCAL1 die Transkription regulieren kann, indem es die Konformation von ^DNA24 verändert. Die CD-Spektroskopie lieferte eine einfache und zugängliche Methode, um diese Hypothese zu validieren.

SMARCAL1 ist ein ATP-abhängiges Chromatin-Remodeling-Protein, das in erster Linie als glühende Helikase fungiert25,26,27. Es wurde postuliert, die Transkription durch Umgestaltung der DNA-Konformation zu ^modulieren24. Um diese Hypothese zu testen, wurde die Rolle von SMARCAL1 bei der Regulierung der Gentranskription während Doxorubicin-induzierter DNA-Schäden untersucht. In diesen Studien wurde SMARCAL1 für die In-vivo-Analyse und ADAAD für In-vitro-Assays ^{verwendet28,29}. Frühere Studien haben gezeigt, dass ADAAD DNA strukturabhängig, aber sequenzunabhängig erkennen ^kann30,31. Das Protein bindet optimal an DNA-Moleküle, die Doppelstrang-zu-Einzelstrang-Übergangsregionen besitzen, ähnlich der Stammschleifen-DNA, und hydrolysiert ATP ^30,31.

In-vivo-Experimente zeigten, dass SMARCAL1 die Expression von MYC, DROSHA, DGCR8 und DICER reguliert, indem es an die Promotorregionen bindet28,29. Die Region der Interaktion wurde durch ChIP-Experimente ^{identifiziert28,29}. Die ChIP-Technik wird verwendet, um die Interaktion eines Proteins mit seiner verwandten DNA innerhalb der Zelle zu analysieren. Ziel ist es, festzustellen, ob bestimmte Proteine, wie Transkriptionsfaktoren auf Promotoren oder anderen DNA-Bindungsstellen, an bestimmte genomische Bereiche gebunden sind. Das an die DNA gebundene Protein wird zunächst mit Formaldehyd vernetzt. Es folgt die Isolierung des Chromatins. Das isolierte Chromatin wird entweder durch Beschallung oder Nukleaseverdauung auf 500 bp-Fragmente geschert, und das an dna gebundene Protein wird mit proteinspezifischen Antikörpern immunpräzipitiert. Die Vernetzung wird umgekehrt und die DNA wird entweder mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder quantitativer Real-Time-PCR analysiert.

Die ChIP-Ergebnisse führten zu der Hypothese, dass SMARCAL1 möglicherweise eine transkriptionelle Regulation vermittelt, indem es eine Konformationsänderung in den Promotorregionen dieser Gene induziert. QGRS-Mapper und Mfold-Software wurden verwendet, um das Potenzial dieser Projektträgerregionen zur Bildung sekundärer Strukturen zu ^{ermitteln28,29}. QGRS Mapper wird zur Vorhersage von G-Quadruplexen32 verwendet, während ^Mfold33 die Fähigkeit einer Sequenz analysiert, sekundäre Strukturen wie Stammschleifen zu bilden.

Nach der Sekundärstrukturanalyse wurden weitere In-vitro-Experimente mit rekombinanter 6X His-tagged Active DNA-abhängiger ATPase A Domain (ADAAD), dem Rinderhomolog von SMARCAL1, gereinigt aus Escherichia coli34, durchgeführt. ATPase-Assays wurden unter Verwendung von ADAAD durchgeführt, um festzustellen, dass die identifizierten DNA-Sequenzen als Effektoren wirken ^{könnten28,29}. Schließlich wurde cd-Spektroskopie durchgeführt, um die durch ^ADAAD28,29 induzierten Konformationsänderungen im ^DNA-Molekül zu überwachen.

Um nachzuweisen, dass die ATPase-Aktivität des Proteins für die Induktion einer Konformationsänderung im DNA-Molekül essentiell war, wurde entweder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zu Mg⁺² oder Aktiver DNA-abhängiger ATPase-A-Domäneninhibitor Neomycin (ADAADiN), ein spezifischer Inhibitor des SWI/SNF-Proteins, ^{hinzugefügt35,36} . Diese CD-spektroskopische Technik kann mit jedem gereinigten Protein verwendet werden, das durch ChIP oder einen anderen relevanten Assay nachgewiesen wurde, um an eine vorhergesagte genomische Region eines Promotors zu binden.

Protocol

1. Arbeitskonzentration der Reaktionskomponenten Die Arbeitskonzentrationen von Puffern für CD und andere Reaktionskomponenten frisch vorbereiten (siehe Tabelle 1) und bei 4 °C halten, bevor die Reaktionen aufgebaut werden.ANMERKUNG: Für die in dieser Arbeit beschriebenen CD-Reaktionen sind die Arbeitskonzentrationen der Komponenten wie folgt: Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Protein 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM….

Representative Results

ADAAD stabilisiert eine stammschleifenartige Struktur auf dem MYC-Promotor Frühere experimentelle Beweise zeigten, dass SMARCAL1 ein negativer Regulator von MYC29 ist. Die Analyse der 159 bp langen Promotorregion des MYC-Gens durch den QGRS-Mapper zeigte, dass der vordere Strang das Potenzial hatte, einen G-Quadruplex zu bilden (Tabelle 2). Mfold zeigte, dass beide Stränge der MYC-DNA eine…

Discussion

Der Zweck dieses Artikels ist es, die CD-Spektroskopie-Technik als einen Ansatz zur Untersuchung der Konformationsänderungen in der DNA in Gegenwart von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Proteinen einzuführen und diese Konformationsänderungen mit der Genexpression zu verknüpfen. Die CD-Spektroskopie bietet eine schnelle und leicht zugängliche Methode, um die Konformationsänderungen in der DNA zu untersuchen.

Ein entscheidender Punkt, der bei dieser Technik zu berücksichtigen …

Materials

2-Mercaptoethanol	Fisher scientific	O3446I-100
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate	Sigmaaldrich	A2383
CD Quartz Cuvette	STARNA	21-Q-1
Chirascan V100 CD spectrometer	Applied Photophysics	Not available
EDTA Disodium Salt Dihydrate	SRL	43272
Glutathione Sepharose 4B	GE Healthcare	17-0756-01	Glutathione affinity chromatography
Hellmanex III cleaning solution	Hellma	9-307-011-4-507
L-Lactic Dehydrogenase	Sigmaaldrich	L2625
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher scientific	BP215-500
Magnesium Chloride Hexahydrate	Fisher scientific	M33-500
NADH disodium salt	Sigmaaldrich	10107735001
Phosphoenolpyruvate Monocyclohexylammonium Salt	SRL	40083
Potassium Acetate	Fisher scientific	P178-3
Pyruvate Kinase	Sigmaaldrich	P1506
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher scientific	S374-500
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate	Fisher scientific	S369-500
Synergy HT microplate reader	BioTek	Not available
Tris Base	Fisher scientific	BP152-500