Полуцелевая сверхвысокоэффективная хроматография в сочетании с масс-спектрометрическим анализом фенольных метаболитов в плазме пожилых людей
Summary
Целью данного протокола является обнаружение фенольных метаболитов в плазме с помощью полуцелевого метода хроматографии-масс-спектрометрии.
Abstract
Группе из 23 пожилых людей давали функциональное питание (напиток и кекс), специально разработанное для профилактики саркопении (возрастной потери мышечной массы). Образцы плазмы брали в начале вмешательства и через 30 дней употребления функциональных приемов пищи. Для выявления фенольных соединений и их метаболитов была проведена полуцелевая ультравысокоэффективная хроматография в сочетании с анализом тандемной массы (UPLC-MS/MS). Белки плазмы осаждали этанолом, а образцы концентрировали и повторно суспендировали в подвижной фазе (1:1 ацетонитрил: вода) перед инъекцией в инструмент UPLC-MS/MS. Разделение проводили с помощью реверсивной фазовой колонны C18 , и соединения идентифицировали с использованием их экспериментальной массы, изотопного распределения и структуры фрагментов. Интересующие соединения сравнивались с соединениями банков данных и внутренней полуцелевой библиотеки. Предварительные результаты показали, что основными метаболитами, выявленными после вмешательства, были фенилуксусная кислота, глицитин, 3-гидроксифенилвалеровая кислота и гомизин М2.
Introduction
Саркопения является прогрессирующим скелетным расстройством, связанным с ускоренной потерей мышц у пожилого населения. Такое состояние увеличивает риск падений и приводит к ограниченной деятельности повседневной жизни. Саркопения присутствует примерно у 5-10% лиц старше 65 лет и около 50% лиц в возрасте 80 лет и старше1. Для лечения саркопении не было одобрено никаких специфических препаратов, поэтому важна профилактика с физической активностью и сбалансированной диетой1,2. Питательные вмешательства со специально разработанными продуктами, обогащенными молочным белком и незаменимыми аминокислотами, показали положительные результаты в предотвращении саркопении2. В других исследованиях авторы включили в рацион витамины и антиоксиданты, такие как витамин Е и изофлавоны, увеличивая преимущества для увеличения мышечной массы на талии и бедрах3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) — дерево, произрастающее в мексиканских тропических регионах; он потребляется культурами майя из-за его высокой питательной ценности4. Это хороший источник белка, клетчатки, минералов и фенольных антиоксидантов, таких как хлорогеновая кислота5. Поскольку его можно измельчать в порошок и использовать в хлебобулочных изделиях или потреблять в напитках, недавние исследования оценили включение семенной муки Рамона (RSF) в различные продукты для улучшения их питательной ценности. Был разработан напиток со вкусом капучино, дополненный RSF, который был с высоким содержанием пищевых волокон и содержал более 6 г белка на порцию и был высоко принят потребителями; таким образом, он рассматривался в качестве потенциальной альтернативы для удовлетворения особых диетических требований6. В последующем исследовании RSF также использовался для приготовления кекса и нового напитка, богатого белком, пищевыми волокнами, микроэлементами и фенольными антиоксидантами. Кекс и напиток использовались в диетическом вмешательстве для пожилых людей, которые потребляли оба продукта два раза в день в течение 30 дней. После этого периода улучшился питательный и саркопенический статус участников, а общее фенольное содержание в плазме увеличилось7. Однако определение общих фенольных соединений в плазме проводили спектрофотометрическим методом, поэтому идентификация фактических фенольных соединений, которые были поглощены, была невозможна; более того, этот метод не является полностью специфичным для фенольных соединений, поэтому может произойти некоторое завышение8.
Идентификация и количественная оценка фенольных соединений, которые всасываются после потребления продуктов, богатых этими антиоксидантами, является сложной задачей, но необходима для демонстрации биологической активности этих фитохимических веществ. Биодоступность большинства фенольных соединений низкая; менее 5% из них можно обнаружить без структурной трансформации в плазме. Фенольные соединения подвергаются нескольким биотрансформациям, таким как метилирование, сульфирование или глюкуронизация, которые осуществляются энтероцитами и гепатоцитами9. Фенольные соединения также биотрансформируются микробиотой в бактериальные катаболиты, которые могут оказывать свое благотворное влияние на организм после всасывания в плазму10. Например, фенилуксусная кислота является продуктом бактериальной трансформации флавоноидов и олигомерных проантоцианидинов, которые могут ингибировать до 40% адгезии бактерий (Escherichia coli) в мочевыводящих путях после потребления клюквы11.
Структурное разнообразие встречающихся в природе фенольных соединений, в сочетании с разнообразием их метаболитов и их низкой биодоступностью, делает их идентификацию в плазме еще более сложной. Метаболомное профилирование с использованием платформ спектроскопического анализа, таких как ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и тандемная масс-спектроскопия (MS / MS), вероятно, является лучшим подходом для достижения этой цели; к сожалению, оборудование не является легкодоступным, а разработка протоколов анализа по-прежнему ограничена12. В нескольких исследованиях сообщалось о РС / МС в сочетании с системой разделения (такой как жидкостная хроматография) в качестве стратегии снижения сложности масс-спектров в метаболомических исследованиях. Недавнее внедрение методов разделения сверхвысокопроизводительной жидкостной хроматографии (UPLC) сократило время анализа и повысило разрешение и чувствительность по сравнению с обычными высокопроизводительными жидкостными протоколами, поэтому системы UPLC-MS/MS быстро получили широкое признание сообщества аналитической метаболомики13. Таким образом, некоторые исследования исследовали фенольные метаболиты и обнаружили глюкуронизированные производные из кофейной кислоты, кверцетина и феруловой кислоты, а также сульфированные производные из сиринговой и ванильной кислоты в плазме лиц после приема клюквы14. Предыдущие протоколы предназначались для поиска фенольных соединений и фенольных метаболитов в биожидкостях, таких как плазма. Эти протоколы были основаны на идентификации и количественной оценке с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), соединенной с УФ-ви-детектором15. Тем не менее, такие протоколы требуют использования аутентичных стандартов для оценки абсолютной идентификации и точной количественной оценки. Широкий круг исследований выявил наиболее распространенные метаболиты в биожидкостях (сульфированные, глюкуронизированные и метилированные формы) UPLC-MS и UPLC-MS/MS; однако большая часть бактериальных метаболитов не была зарегистрирована из-за отсутствия баз данных, содержащих их полную информацию16. Идентификация метаболитов осложняется стоимостью и коммерческой доступностью стандартов метаболитов. Поэтому наилучшей стратегией может быть нецелевой или полуцелевой анализ метаболитов РС/МС, который опирается на использование информации о молекулярных признаках (m/z, моноизотопная точная масса, изотопное распределение и паттерн фрагментации) для определения химической идентичности и сравнивает ее со свободно доступными онлайн-базами данных, содержащими полифенольные метаболиты, идентифицированные в биожидкостях после потребления полиполифенол-рихттов12 . Наиболее важными базами данных, используемыми в исследованиях UPLC-MS / MS для идентификации фенольных соединений и их метаболитов, являются база данных метаболомов человека (HMDB), библиотека LipidBlast, библиотека METLIN и другие дополнительные базы данных, такие как PubChem, ChemSpider и Phenol Explorer17.
В настоящем исследовании был разработан полуцелевой метод UPLC-MS/MS для анализа образцов плазмы группы пожилых людей, участвующих в исследовании потребления кекса и напитков, содержащих RSF7. Данные из различных бесплатных онлайн-баз данных метаболитов плазмы были собраны и интегрированы в специализированную базу данных. Эта база данных может быть автоматически доступна программному обеспечению оборудования для идентификации полифенольных метаболитов в пяти образцах плазмы до и после 30-дневного вмешательства в питание. Это делается для выявления основных фенольных соединений, или их метаболитов, которые всасываются из специально разработанных функциональных продуктов, предназначенных для профилактики саркопении.
Protocol
Representative Results
Discussion
Идентификация и количественная оценка биологически активных фитохимических веществ, которые поглощаются после употребления пищи или пищевой добавки, имеют решающее значение для демонстрации и понимания пользы для здоровья этих соединений и продуктов, содержащих их. В настоящей рабо…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны за финансовую поддержку со стороны CONACYT, Мексика (CB-2016-01-286449) и UACJ-PIVA (проекты 313-17-16 и 335-18-13). OAMB хотел бы поблагодарить CONACYT за его стипендию Ph.D. Мы с благодарностью благодарим техническую поддержку от офиса Multimedia Production от UACJ.
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi, ., Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
