Summary
O objetivo deste protocolo é detectar metabólitos fenólicos no plasma usando um método de espectrometria de massa cromatografia-masscamo semi-direcionada.
Abstract
Um grupo de 23 idosos recebeu refeições funcionais (uma bebida e um muffin) especialmente formuladas para a prevenção da sarcopenia (perda de massa muscular relacionada à idade). Amostras de plasma foram colhidas no início da intervenção e após 30 dias de consumo das refeições funcionais. Foi realizada uma cromatografia ultra-alta performance semi-direcionada juntamente com a análise de massa tandem (UPLC-MS/MS) para identificar compostos fenólicos e seus metabólitos. As proteínas plasmáticas foram precipitadas com etanol e as amostras foram concentradas e resuspendidas na fase móvel (acetonitrilo 1:1: água) antes da injeção no instrumento UPLC-MS/MS. A separação foi realizada com uma coluna de fase inversa C18 , e os compostos foram identificados utilizando sua massa experimental, distribuição isotópica e padrão de fragmento. Os compostos de juros foram comparados aos dos bancos de dados e da biblioteca interna sem-direcionada. Os resultados preliminares mostraram que os principais metabólitos identificados após a intervenção foram ácido fenídrico, glicacitina, ácido 3-hidroxifenilvalerico e gomisina M2.
Introduction
Sarcopenia é um transtorno esquelético progressivo relacionado à perda acelerada de músculos na população idosa. Essa condição aumenta o risco de quedas e leva a atividades limitadas da vida diária. A sarcopenia está presente em cerca de 5%-10% das pessoas com mais de 65 anos e cerca de 50% das pessoas com 80 anos ou mais de idade1. Nenhum medicamentos específicos foi aprovado para o tratamento da sarcopenia, por isso a prevenção com atividade física e uma dieta bem equilibrada é importante1,2. Intervenções nutricionais com alimentos especialmente formulados enriquecidos com proteína leiteira e aminoácidos essenciais têm mostrado resultados positivos na prevenção da sarcopenia2. Em outros estudos, os autores incluíram vitaminas e antioxidantes, como vitamina E e isoflavonas, na dieta, aumentando os benefícios para o ganho muscular na cintura e nos quadris3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) é uma árvore que cresce nas regiões tropicais mexicanas; tem sido consumida por culturas maias devido ao seu alto valor nutricional4. É uma boa fonte de proteínas, fibras, minerais e antioxidantes fenólicos, como o ácido clorogênico5. Como pode ser moído em pó e usado em produtos de panificação ou consumidos em bebidas, estudos recentes têm avaliado a incorporação da farinha de sementes de Ramón (RSF) em diferentes alimentos para melhorar seu valor nutricional. Uma bebida com sabor de cappuccino suplementada pela RSF foi formulada, que era rica em fibras alimentares e tinha mais de 6 g de proteína por porção, e era altamente aceita pelos consumidores; assim, considerou-se uma alternativa potencial para atender aos requisitos alimentares especiais6. Em um estudo de acompanhamento, a RSF também foi usada para formular um muffin e uma nova bebida rica em proteínas, fibras alimentares, micronutrientes e antioxidantes fenólicos. O muffin e a bebida foram utilizados em uma intervenção dietética para idosos, que consumiram ambos os produtos duas vezes por dia durante 30 dias. Após esse período, o estado nutricional e sarcopenico dos participantes melhorou, e o teor fenólico total do plasma aumentou7. No entanto, a determinação dos compostos fenólicos totais no plasma foi realizada por um método espectrofotométrico, de modo que a identificação dos compostos fenólicos reais que foram absorvidos não foi possível; além disso, este método não é completamente específico para compostos fenólicos, de modo que alguma superestimação pode ocorrer8.
A identificação e quantificação dos compostos fenólicos que são absorvidos após o consumo de alimentos ricos nesses antioxidantes é uma tarefa difícil, mas é necessária para demonstrar a atividade biológica desses fitoquímicos. A biodisponibilidade da maioria dos compostos fenólicos é baixa; menos de 5% deles podem ser encontrados sem transformação estrutural no plasma. Os compostos fenólicos passam por várias biotransformações, como metilação, sulfonação ou glucuronidação, que são realizadas por enterócitos e hepatócitos9. Compostos fenólicos também são biotransformados pela microbiota em catabólitos bacterianos que podem exercer seus efeitos benéficos no corpo após serem absorvidos pelo plasma10. Por exemplo, o ácido fenilacetic é um produto da transformação bacteriana de flavonoides e proanthociaanidinas oligomerícos, que podem inibir até 40% da adesão de bactérias (Escherichia coli) no trato urinário após o consumo de cranberry11.
A diversidade estrutural de compostos fenólicos de ocorrência natural, somada à diversidade de seus metabólitos e sua baixa biodisponibilidade, torna sua identificação no plasma ainda mais desafiadora. O perfil metabolômico, utilizando plataformas de análise espectroscópica, como ressonância magnética nuclear (RMN) e espectroscopia de massa tandem (MS/MS), é provavelmente a melhor abordagem para alcançar esse objetivo; infelizmente, o equipamento não é facilmente acessível, e o desenvolvimento de protocolos de análise ainda é limitado12. Vários estudos têm relatado a ESM/MS juntamente com um sistema de separação (como a cromatografia líquida) como estratégia para reduzir a complexidade dos espectros de massa em estudos metabolômicos. A recente introdução de métodos de separação de cromatografia líquida de alto desempenho (UPLC) reduziu o tempo de análise e aumentou a resolução e sensibilidade em comparação com os protocolos líquidos convencionais de alto desempenho, de modo que os sistemas UPLC-MS/MS têm sido rapidamente amplamente aceitos pela comunidade de metabolômicas analítica13. Dessa forma, alguns estudos investigaram metabólitos fenólicos e detectaram derivados colacuronidados de ácido cafeína, quercetina e ácido ferúlico, bem como derivados sulfoados de ácido seringa e vanlícita no plasma de indivíduos após a ingestão de cranberry14. Protocolos anteriores têm a intenção de encontrar compostos fenólicos e metabólitos fenólicos em biofluidos como plasma. Estes protocolos foram baseados na identificação e quantificação por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) acoplado a um detector UV-vis15. No entanto, tais protocolos exigem o uso de padrões autênticos para avaliar a identificação absoluta e quantificação precisa. Uma ampla gama de estudos identificou os metabólitos mais comuns em biofluidos (formas sulfotadas, glucuronidas e metiladas) por UPLC-MS e UPLC-MS/MS; no entanto, grande parte dos metabólitos bacterianos não foi relatada devido à falta de bancos de dados que contenham suas informações completas16. A identificação metabólica é complicada pelo custo e disponibilidade comercial das normas metabólitos. Portanto, a melhor estratégia pode ser a análise metabólica MS/MS sem alvo ou semi-direcionada, que se baseia no uso de informações de características moleculares (m/z, massa exata monoisotópica, distribuição isotópica e padrão de fragmentação) para determinar a identidade química e compara-a com bancos de dados on-line livremente disponíveis que contêm metabólitos polifenóis identificados em biofluóides após o consumo de polipólitos-richts12 . As bases de dados mais importantes utilizadas em estudos UPLC-MS/MS para identificação de compostos fenólicos e seus metabólitos são o Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library e outros bancos de dados complementares, como PubChem, ChemSpider e Phenol Explorer17.
No presente estudo, foi desenvolvido um método uplc-MS/MS semi-direcionado para analisar as amostras de plasma do grupo de idosos envolvidos no estudo de consumo de muffin e bebidas contendo RSF7. Dados de diferentes bancos de dados online gratuitos de metabólitos de plasma foram coletados e integrados em um banco de dados especializado. Este banco de dados pode ser acessado automaticamente pelo software do equipamento para identificar os metabólitos polifenólicos nas cinco amostras de plasma antes e depois da intervenção nutricional de 30 dias. Isso é feito para identificar os principais compostos fenólicos, ou seus metabólitos, que são absorvidos dos alimentos funcionais especialmente formulados projetados para a prevenção da sarcopenia.
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Protocol
As amostras de plasma utilizadas neste protocolo foram coletadas em estudo prévio seguindo todas as diretrizes éticas e aprovadas pelo Comitê de Ética Institucional e Bioética (CIEB-2018-1-37) da Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. O protocolo completo para a extração e identificação dos compostos fenólicos e metabólitos no plasma pela UPLC-MS/MS está representado na Figura 1.
Figura 1: Representação esquemática da extração e identificação de compostos fenólicos e metabólitos no plasma pelo método UPLC-MS/MS semi-direcionado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Preparação da amostra
- Armazene as amostras de plasma a -80 °C até a análise.
- Descongele as amostras de plasma à temperatura ambiente por 15 minutos.
NOTA: As amostras podem ser colocadas em banho-maria a 37 °C para acelerar o processo (5 min). - Coloque 200 μL de amostra de plasma em um microtubo de 2 mL e misture com 1.000 μL de etanol puro. Vórtice a amostra de plasma para 30 s.
NOTA: Use sempre luvas ao trabalhar com amostras de plasma. - Centrifugar a amostra a 6.580 x g por 5 min. Após a centrifugação, colete o supernatante com uma micropipette ou pipeta Pasteur e coloque-o em um novo microtubo. Armazene o supernatante a 4 °C.
- Misture a pelota da etapa anterior com 1.000 μL de 100% etanol, vórtice para 30 s e, em seguida, centrífuga a 6.580 x g por 5 min.
NOTA: A pelota é fortemente embalada e precisa ser bem resuspended bem para garantir o contato entre a amostra e o etanol puro. Recomenda-se o uso de uma micropipette para lavar a pelota com etanol. - Após a centrifugação, colete o supernante e misture com o sobrenatante previamente obtido a partir da Etapa 1.4. em um microtubo de 2 mL.
- Remova o etanol da amostra usando nitrogênio puro (99,997%) a 135 psi. Mantenha a agulha a 1 cm de distância da parte superior do microtubo para evitar a perda da amostra e lave até que a amostra esteja seca. Não é necessário calor para evaporar o etanol.
NOTA: O fluxo de nitrogênio deve ser baixo para evitar a perda de amostras. Uma vez que o etanol esteja seco, mantenha o fluxo de nitrogênio por pelo menos 5 minutos para garantir o ressecamento da amostra. O protocolo pode ser pausado neste momento; as amostras devem ser armazenadas a -20 °C. Evite armazenar as amostras por mais de 12 h. - Resuspenque as amostras secas em 100 μL de uma mistura de acetonitrilo: água em uma proporção de 50:50 (v:v).
- Filtre a amostra através de uma membrana de seringa de nylon de 0,45 μm diretamente em uma micro inserção de frasco HPLC.
NOTA: As amostras do frasco podem ser armazenadas a -20 °C antes da análise. Armazene as amostras por não mais do que 8h. Recomenda-se injetar as amostras no sistema UPLC logo após a filtragem.
2. Análise UPLC-MS/MS
- Injete 3 μL de amostra em um UPLC equipado com uma coluna de fase reversa C18 (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Coloque a temperatura do autosampler a 20 °C e o termostato da coluna a 25 °C. Injete cada amostra em triplicado.
- Use 0,1% (v:v) ácido fórmico na água como solvente A, e 100% acetonitrilo como solvente B. Definir a taxa de fluxo em 0,4 mL/min e um programa gradiente da seguinte forma: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (Tabela 1).
- Ajuste o espectrômetro de massa para ionização de modo negativo. Use nitrogênio como gás de secagem a 340 °C e uma vazão de 13 L/min. Coloque a pressão do nebulizador em 60 psi. Coloque a tensão capilar em 4.000 V, a tensão fragmentor a 175 V e a tensão skimmer a 65 V. Use energia de colisão a 20 V (Tabela 2).
- Escaneie as massas entre 100-1100 massas para taxa de carga (m/z) e, para MS/MS, escaneie massas entre 50-1000 m/z (Tabela 2). Defina a aquisição de dados para o modo MS/MS automático. Utilize a seguinte massa de referência: 119.036 e 966.0007.
| Tempo (min) | Solvente A (0,1 % ácido fórmico na água HPLC) | Solvente B (100 % acetonitrilo) |
| 0 a 1 | 90 | 10 |
| 1 a 4 | 70 | 30 |
| 4 a 6 | 62 | 38 |
| 6 a 8 | 40 | 60 |
| 8 a 8,5 | 40 | 60 |
| 8,5 a 9 | 90 | 10 |
Tabela 1: Gradiente de fase móvel utilizado para a separação de compostos fenólicos por UPLC.
| Modo de ionização | Negativo |
| Gás de secagem | Nitrogênio a 340 °C, vazão 13 L/min |
| Pressão de nebulizador | 60 psi |
| Tensão capilar | 175 V |
| Massas de varredura de MS | 100-1100 m/z |
| Massas de varredura MS/MS | 50-1000 m/z |
Tabela 2: Parâmetros de ionização para a análise de MS/MS.
3. Construção de banco de dados
- Busca por compostos fenólicos, metabólitos fenólicos ou outros compostos de interesse na literatura científica.
- Abra o software de gerenciamento de banco de dados incluído no sistema UPLC. Selecione | de arquivos Nova biblioteca composta de banco de dados pessoal (PCDL) | Criar novo PCDL. Selecione o tipo de PCDL: Metabolômica LC/MS. Defina um nome para o PCDL. Em seguida, selecione Criar.
- Na barra de ferramentas, selecione PCDL e, em seguida, a opção Permitir a edição . Em seguida, clique no botão Encontrar compostos .
NOTA: Por se trata de um novo PCDL, os resultados da tabela estarão vazios. Isso mudará assim que novos compostos forem adicionados ao PCDL.- Adicione compostos à biblioteca de compostos especializados do banco de dados pessoal copiando-os da biblioteca geral do instrumento. Abra o banco de dados existente do instrumento incluído no software de gerenciamento de banco de dados. Clique no botão Encontrar compostos. Na opção de pesquisa Única , insira os critérios de pesquisa compostos para encontrar o composto de interesse.
NOTA: Os compostos podem ser encontrados pelo nome, fórmula molecular, massa exata e tempo de retenção. - Na tabela de resultados compostos, selecione o composto de juros. Para selecionar mais de um composto, clique no primeiro composto, segure a tecla CTRL e clique em cada composto de interesse. Em seguida, clique com o botão direito do mouse em todos os compostos destacados e selecione Apêndice para PCDL.
- Na nova janela, pesquise e selecione o arquivo especializado de banco de dados pessoal. Marque as caixas Inclua espectros para compostos se presentes e Inclua informações de mobilidade de íons para compostos, se presente. Clique no botão Anexar . Na nova caixa de diálogo, selecione Sim para verificar os novos compostos adicionados. Selecione Não para continuar procurando por mais compostos de interesse.
- Adicione compostos à biblioteca de compostos especializados do banco de dados pessoal copiando-os da biblioteca geral do instrumento. Abra o banco de dados existente do instrumento incluído no software de gerenciamento de banco de dados. Clique no botão Encontrar compostos. Na opção de pesquisa Única , insira os critérios de pesquisa compostos para encontrar o composto de interesse.
- Se os compostos de interesse não estiverem disponíveis na biblioteca geral do instrumento, adicione novos compostos manualmente.
- Abra o banco de dados pessoal especializado. Uma vez aberto, siga o Passo 3.3. Selecione a opção Editar compostos . Clique no botão Adicionar novo .
- Na parte superior da janela, complete as informações para o novo composto. Preencha a fórmula, nome, nome IUPAC, número CAS, ID Chemspider e outros identificadores.
- Use as informações disponíveis nas bibliotecas online gratuitas (Chemspider, PubChem e Phenol Explorer) para preencher as informações para o novo composto de interesse. Uma vez terminado, clique no botão Salvar como novo para salvar as novas informações do composto no banco de dados pessoal especializado.
NOTA: Ao adicionar informações de bibliotecas gratuitas, certifique-se de incluir as informações do composto sem a presença de íons de cloreto ou iodeto. Isso pode modificar a massa exata e a fórmula molecular do composto de interesse.
- Repita o processo com todos os compostos de interesse para concluir o banco de dados pessoal especializado.
4. Análise de dados
- Utilize o software qualitativo do instrumento para identificar os compostos fenólicos e metabólitos fenólicos presentes nas amostras.
- Abra o arquivo de amostra. No painel cromatograma, selecione Definir Cromatogramas e extrair o cromatógrama de íon total (TIC), o íon-cromatgrama extraído de MS (EIC) e o EIC de MS/MS. Selecione a opção de cromatograma integrado.
- No painel Encontrar compostos , selecione Encontrar por Opções de Fórmula. Na nova janela, selecione A Fonte de Fórmula e, em seguida, a opção Banco de Dados/Biblioteca . Encontre o banco de dados pessoal criado anteriormente e clique em Abrir.
- Selecione a opção Formula Matching e defina uma tolerância de correspondência em massa de 5 partes por milhão (ppm).
NOTA: Uma tolerância de correspondência diferente das massas pode ser definida em 10 ppm; essa diferença depende do espectrômetro de massa utilizado. - Selecione a opção Íons Negativos e selecione apenas a caixa de diálogo -H . Na opção Resultados , marque o Extrato EIC, Extraia espectro limpo, extraia espectro bruto e inclua caixas de diálogo estrutura.
- Selecione a opção Filtros de resultado . Mark Warn se o placar for e definir a pontuação em 80,00%. Mark Não corresponde se o placar for e definir a pontuação em 75,00%.
NOTA: As pontuações de correspondência/não podem ser alteradas para valores mais baixos, se necessário. Isso reduzirá a precisão da identificação. - Clique no Find Compounds by Formula para identificar compostos de interesse na amostra.
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Representative Results
O processo passo-a-passo para a identificação de metabólitos fenólicos através da análise uplc-MS/MS semi-direcionada, em modo negativo, de amostras de plasma é retratado na Figura 2. Primeiro, o cromatógrama de íon total (TIC) do extrato de fenólicos plasmáticos (obtido após precipitação proteica da amostra de plasma total) foi obtido através do software qualitativo do instrumento. Em seguida, foi utilizado o cromatógrama de íon extraído, e o padrão exato de massa e fragmentação (análise ms/MS) de cada sinal (ou característica molecular) foi comparado com o de um banco de dados pessoal específico criado também no software do instrumento. Sinais com uma combinação de massa de menos de 5 ppm foram atribuídos a uma fórmula molecular do banco de dados. Finalmente, a distribuição isotópica de cada sinal foi comparada com a da fórmula molecular atribuída para alcançar a identificação provisória final. Os compostos que a) foram identificados apenas em uma réplica ou b) apresentaram uma área inferior a 10.000 foram tratados como identificações falsas. A partir desta análise, foram identificados 25 compostos fenólicos e metabólitos nas amostras de plasma (Tabela 3). Nesta lista, foram encontrados compostos fenólicos e seus metabólitos, como ácido 3-hidroxifenilvalerico e isopropílico 3-(3,4-dihidroxifenil)-2-hidroxipropanoato. Uma vez que o modo de ionização negativa é mais adequado para todas as classes de compostos fenólicos, exceto antocianinas, esses compostos não puderam ser detectados com o método atual. Se as antocianinas são componentes importantes da matriz alimentar, o modo positivo também deve ser utilizado.
| Metabólitos fenólicos | R.T. (min) | Fórmula | Precursor | Massa experimental | Massa teorical | Diferença (ppm) | |
| 2,3-Ácido dihidroxybenómico | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| Ácido 2-Hidroxyhippúrico | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-Dihydroxytolueno | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| Ácido 3-Hidroxifenilvalerico | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-dihidroxyphenyl)-ácido valerico | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Hidroxyenterodiol | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Ajugol | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Ácido benzoico | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Ácido carnosico | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Carnosol | 6.347 | C20h26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Catecol | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Glicocitina | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Hesperetina | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Ácido hippurico | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Ácido homovanillic | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| Isopropil 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-hidroxipropanoate | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Ácido fenílaceso | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Ácido fleótico | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Aldeído protocárrico | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinol | 8.837 | C20h26o6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Vanilina | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Epicatechin 3'-O-glucuronida | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Gomisin M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| Irisolidone | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Urolithin C | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Tabela 3: Identificação provisória de compostos fenólicos e metabólitos em amostras de plasma pelo método UPLC-MS/MS semi-direcionado.
Para avaliar a eficácia do método projetado para a identificação dos principais compostos fenólicos, ou seus metabólitos, que foram absorvidos do muffin e bebida contendo RSF, foram analisadas cinco amostras de chumbo dos participantes do estudo, obtidas antes e depois da intervenção de 30 dias. A abundância relativa de cada composto foi calculada dividindo a área sob a curva (AUC) após o tratamento pela AUC antes do tratamento. A partir dessa análise, foi possível observar que alguns compostos só apareceram nas amostras obtidas antes do tratamento, outros permaneceram inalterados, enquanto alguns deles aumentaram após o consumo dos alimentos funcionais. A Tabela 4 mostra a lista de 12 compostos fenólicos que apresentaram aumento no plasma após o consumo de 30 dias dos alimentos contendo RSF. O ácido fenílaceso foi o único metabólito encontrado consistentemente em concentrações mais elevadas após o tratamento. Glycitin, uma isoflavona glicosilada, e ácido 3-hidroxifenilvalerico (um metabólito fenólico) aumentaram em três das cinco amostras, mas diminuíram nas outras duas. Gomisin M2, um lignan, foi detectado em três das cinco amostras somente após a intervenção nutricional. Os outros compostos fenólicos (como hesperetina, secoisolariciresinol e vanillina) e metabólitos (como ácido 2-hidroxihippúrico) foram encontrados apenas em uma amostra e somente após o tratamento.
| Amostra (AUC após tratamento/AUC antes do tratamento) | |||||||
| Composto | Fórmula | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Ácido 2-Hidroxyhippúrico | C18H33NO4 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Ácido 3-Hidroxifenilvalerico | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Hidroxyenterodiol | C18H22O5 | Nd | Nd | T | Nd | Nd | |
| Glicocitina | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Hesperetina | C16H14O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Ácido fenílaceso | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Ácido fleótico | C9H10O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Aldeído protocárrico | C7H6O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Secoisolariciresinol | C20h26o6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Vanilina | C8H8O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Gomisin M2 | C22H26O6 | Nd | T | T | T | Nd | |
Tabela 4: Lista de compostos fenólicos que aumentaram no plasma de idosos após 30 dias de consumo de alimentos contendo RSF. Os dados são as razões da abundância (AUC) de cada composto após o tratamento em comparação com sua abundância antes do tratamento. T indica que o composto só foi identificado na amostra após o tratamento. Nd: não detectado.
Figura 2: Protocolo para identificação de metabólitos compostos fenólicos por UPLC-MS/MS semi-direcionados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A identificação e quantificação dos fitoquímicos bioativos que são absorvidos após o consumo de um suplemento alimentar ou alimentar são cruciais para demonstrar e compreender os benefícios para a saúde desses compostos e dos alimentos que os contêm. No presente trabalho, foi desenvolvido o método UPLC-MS/MS, voltado apenas para a identificação dos principais compostos fenólicos e seus metabólitos que aumentaram na concentração no plasma após uma intervenção nutricional de 30 dias com dois produtos alimentícios especialmente formulados para idosos. Presumiu-se que, se um composto aumentasse ou aparecesse no plasma somente após o período de intervenção, esse composto havia sido absorvido e/ou biotransformado dos alimentos utilizados na intervenção.
O UPLC-MS/MS é uma das tecnologias preferidas para estudos metabolômicos nos quais muitos compostos de baixo peso molecular são analisados simultaneamente em amostras complexas para avaliar o efeito de algum tratamento ou alteração ambiental13. Isso pode ser feito através de métodos direcionados e não direcionados (ou globais). As análises direcionadas se concentram em um número conhecido e pequeno de metabólitos de interesse. São a melhor opção para quantificar compostos com padrões disponíveis, proporcionando a melhor especificidade e sensibilidade; no entanto, esses métodos devem ser completamente otimizados para os metabólitos selecionados e são incapazes de detectar compostos inesperados nas amostras12. Em outros estudos, o HPLC juntamente com um detector UV-vis tem sido usado para identificar ácidos fenólicos e metabólitos no plasma, mas este tipo de estudo tem usado padrões analíticos para identificar e quantificar o composto de juros15. Em outro estudo, foi proposta a adição de uma norma interna18; no entanto, apenas ácidos féráficos e cafeíacos e seus metabólitos foram analisados neste trabalho. Por outro lado, a síntese de padrões internos de metabólitos fenólicos tem sido proposta como alternativa à falta de padrões analíticos comerciais19. No entanto, a síntese de uma grande variedade de compostos fenólicos é difícil, demorada e cara. Métodos não direcionados tentam detectar e identificar o maior número possível de compostos moleculares e são principalmente geradores de hipóteses12. Eles podem identificar várias centenas de compostos em uma amostra, atribuindo fórmulas a sinais cromatográficos detectáveis com características características características, como m/z ou massa precisa medida, tempo de retenção cromatográfica, impressão digital isotópica, etc., de modo que os dados gerados por essas análises são muito abundantes e podem ser difíceis de interpretar20 . Como o objetivo do presente método não era obter um perfil metabólico completo das amostras de plasma (o que seria uma abordagem não direcionada), mas identificar os principais compostos fenólicos e metabólitos fenólicos (até então desconhecidos) neles, foi projetada uma abordagem semi-direcionada. Para isso, todos os sinais identificados foram extraídos automaticamente com o software do instrumento e, em seguida, comparados com um banco de dados auto-criado que continha 645 compostos fenólicos e seus metabólitos, que foram obtidos a partir de bancos de dados online gratuitos. O banco de dados incluiu padrões de fragmentação de MS/MS de referência dos compostos utilizados para a atribuição do nome e fórmula composto, o que permite uma identificação mais precisa dos compostos na amostra12.
Os passos mais críticos do protocolo foram 1) pré-tratamento amostral (extração e concentração de compostos fenólicos e metabólitos a partir de amostras de plasma); 2) a construção de um banco de dados completo e específico para a análise semi-direcionada das amostras e identificação de todos os compostos possíveis pertencentes a uma classe composta específica; e 3) a seleção dos parâmetros utilizados pelo software qualitativo do instrumento (ppm de tolerância à correspondência em massa e pontuação%) para identificar com precisão os compostos da amostra. No pré-tratamento amostral, deve-se ter cuidado para evitar a perda dos compostos de juros, recuperá-los em uma alta concentração final e ser capaz de eliminar compostos interferentes. Na criação do banco de dados específico, é fundamental realizar uma pesquisa minuciosa na literatura e, em seguida, utilizar bancos de dados on-line gratuitos para obter dados químicos específicos que serão utilizados para identificação composta na amostra. A seleção dos melhores valores para correspondência em massa e pontuação exigiu validação prévia do método analítico utilizando normas e amostras conhecidas21,22.
Uma vez implementado o protocolo, os problemas comuns e suas soluções recomendadas foram os seguintes: 1) Não foram identificados compostos nas amostras. Isso se deveu à baixa concentração dos compostos e poderia ser resolvido secando a amostra e re dissolvendo-a em um volume menor. 2) Os sinais apareceram no TIC, mas os compostos não foram identificados. Isso pode ser devido a uma falha na calibração de massa, de modo que a diferença entre massas experimentais e teóricas foi alta. Neste caso, a calibração em massa do instrumento deve ser realizada de acordo com o fabricante e o modelo do equipamento. Uma segunda razão pode ser um banco de dados pessoal incompleto, por isso é fundamental verificar e manter constantemente o banco de dados. Massas de compostos suspeitos de serem de interesse podem ser verificados e comparados com bancos de dados on-line livremente disponíveis ou novas literaturas científicas. 3) Os sinais apareceram em corridas em branco. Isso indica contaminação e pode ser resolvido limpando a agulha e a coluna do autosampler. O protocolo padrão de limpeza é realizar algumas corridas usando metanol, depois isopropanol, e finalmente acetonitrila como a fase móvel. Em seguida, a coluna é ree equilibrada, executando a fase móvel por pelo menos 30 minutos.
As principais dificuldades no desenvolvimento desse tipo de método são 1) a baixa biodisponibilidade, em termos gerais, de todos os fitoquímicos, incluindo compostos fenólicos, que se traduz em concentrações plasmáticas muito baixas16; 2) a alta diversidade de compostos fenólicos presentes nos alimentos, que é aumentada pelo seu metabolismo e biotransformação que ocorrem em enterócitos e heptocitos humanos e microbiotatos coloniais23; 3) a falta de normas (existem algumas normas, mas são muito difíceis de obter) para muitos compostos, especialmente para os metabólitos, e a existência de alguns compostos desconhecidos ou não característicos23; e 4) respostas variáveis entre os indivíduos, tanto na absorção quanto no metabolismo dos fitoquímicos14. Para superar o problema das baixas concentrações plasmáticas de metabólitos fenólicos, eles devem ser extraídos e concentrados. Isso pode ser conseguido por extração micro-fase sólida14 ou, como no presente trabalho, pela adição de solventes que precipitam proteínas e dissolvem compostos fenólicos e metabólitos, seguidos de evaporação de solventes e resuspensão em menor volume19. Esta técnica é simples, econômica e adequada para um pequeno número de amostras. No entanto, a recuperação de compostos de interesse poderia ser facilmente melhorada usando volumes de plasma maiores, de modo que a concentração final de todos os compostos seria maior. A alta diversidade de metabólitos fenólicos e a falta de padrões é a razão pela qual uma abordagem semi-direcionada foi usada para identificar os compostos aumentados pela intervenção antes de tentar quantificá-los. Usando um banco de dados especialmente criado em vez de uma análise completamente não alvo, foi possível ignorar os numerosos metabólitos primários no plasma, focando apenas nos compostos fenólicos e seus metabólitos. Uma limitação importante deste banco de dados, específico para compostos fenólicos e seus metabólitos humanos, foi a falta de informações espectrais em massa para muitos compostos e seus metabólitos, o que reduz a precisão da identificação do composto.
A grande variabilidade entre os indivíduos é observada regularmente em estudos que avaliam a absorção e o metabolismo de compostos fenólicos, tanto quantitivamente quanto qualitativamente. Nos resultados atuais, um indivíduo apresentou 18 compostos na amostra de plasma colhida após a intervenção, enquanto os demais apresentaram apenas 9 ou 10. Além disso, muitos compostos fenólicos e metabólitos foram encontrados apenas nas amostras de linha de base (antes da intervenção), e também variaram entre os indivíduos. No geral, mais da metade dos compostos identificados apresentaram maiores concentrações (AUC) antes do que após a intervenção ou foram encontrados apenas nas amostras pré-intervenção. Por isso, foi necessário comparar amostras individuais colhidas antes e depois da intervenção para entender quais compostos foram realmente aumentados por ela. O único metabólito que aumentou consistentemente após o tratamento foi o ácido feniláctico, um catabólito microbiano de flavan-3-ols24 que tem sido encontrado no plasma de indivíduos em estudos agudos do consumo de alimentos ricos em fenólico14,25. A maioria dos estudos que identificaram e quantificaram metabólitos fenólicos no plasma foram estudos agudos, nos quais as concentrações compostas foram monitoradas durante as 24 horas após o consumo da refeição rica em fenólicos, observando que, após 24 h, suas concentrações estavam próximas ao valor basal19,25. Portanto, é compreensível que as amostras analisadas no presente trabalho apresentem baixos números e concentrações de metabólitos fenólicos. Recentemente, Zhang et al.25 avaliaram o consumo de framboesa vermelha, tanto em estudos agudos quanto após 4 semanas de suplementação. Observaram que tanto as intervenções agudas quanto as crônicas aumentaram os compostos fenólicos e seus metabólitos, enquanto após a suplementação de 4 semanas, a concentração de plasma basal de alguns metabólitos aumentou (urolitrinos, cinâmicos, fenilpropionicos e ácidos hipúicos) e de outros diminuíram (derivados de antocianina conjugada).
Um exame final do método desenvolvido no presente artigo mostra que, na maioria das partes, foi adequado para o objetivo para o qual foi criado. O pré-tratamento amostral foi simples e eficaz, e a separação da UPLC e a identificação semi-direcionada de metabólitos fenólicos foram realizadas. Este método semi-direcionado pode ser útil como uma primeira abordagem de triagem para identificar compostos fenólicos que podem ser absorvidos de diferentes matrizes alimentares, bem como os metabólitos fenólicos presentes no plasma humano. Além disso, o protocolo é útil porque permite a identificação quando não há padrões de compostos fenólicos ou metabólitos disponíveis. Finalmente, o método utiliza uma pequena quantidade de plasma, que é crítica na maioria dos estudos in vivo onde as amostras de plasma são escassas. No entanto, recomenda-se que, para estudos futuros, um estudo agudo seja realizado antes da intervenção crônica para melhor identificar os principais compostos fenólicos e metabólitos absorvidos dos alimentos especialmente formulados.
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Disclosures
Todos os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Os autores agradecem o apoio financeiro da CONACYT, México (CB- 2016-01-286449) e UACJ-PIVA (Projetos 313-17-16 e 335-18-13). A OAMB agradece à CONACYT por sua bolsa de doutorado. O suporte técnico do escritório de Produção Multimídia da UACJ é reconhecido com gratidão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
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