Summary
Målet med denne protokol er at detektere phenolmetabolitter i plasma ved hjælp af en semi-målrettet kromatografi-masse spektrometri metode.
Abstract
En gruppe på 23 ældre fik funktionelle måltider (en drik og en muffin) specielt formuleret til forebyggelse af sarkopeni (aldersrelateret tab af muskelmasse). Plasmaprøver blev taget i begyndelsen af interventionen og efter 30 dages indtagelse af de funktionelle måltider. En semi-målrettet ultra-højtydende kromatografi kombineret med tandemmasse (UPLC-MS/ MS) analyse blev udført for at identificere phenolforbindelser og deres metabolitter. Plasmaproteiner blev udfældet med ethanol, og prøverne blev koncentreret og resuspenderet i den mobile fase (1:1 acetonitril: vand) før injektion i UPLC-MS/MS-instrumentet. Adskillelse blev udført med en C18 omvendt fase kolonne, og forbindelser blev identificeret ved hjælp af deres eksperimentelle masse, isotopfordeling og fragmentmønster. Forbindelser af interesse blev sammenlignet med databanker og det interne semi-målrettede bibliotek. Foreløbige resultater viste, at de vigtigste metabolitter, der blev identificeret efter interventionen, var phenyleddikesyre, glycitin, 3-hydroxyphenylvalerinsyre og gomisin M2.
Introduction
Sarkopeni er en progressiv skeletlidelse relateret til et accelereret tab af muskler i den ældre befolkning. Denne tilstand øger risikoen for fald og fører til begrænsede aktiviteter i dagligdagen. Sarkopeni er til stede hos ca. 5-10 % af personer over 65 år og ca. 50 % af personer i alderen 80 år eller derover1. Der er ikke godkendt specifikke lægemidler til behandling af sarkopeni, så forebyggelse med fysisk aktivitet og en velafbalanceret kost er vigtig1,2. Ernæringsmæssige interventioner med specielt formulerede fødevarer beriget med mælkeprotein og essentielle aminosyrer har vist positive resultater til forebyggelse af sarkopeni2. I andre undersøgelser har forfattere inkluderet vitaminer og antioxidanter, som E-vitamin og isoflavoner, i kosten, hvilket øger fordelene for muskelforøgelse i taljen og hofterne3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) er et træ, der vokser i de mexicanske tropiske regioner; det er blevet indtaget af mayakulturer på grund af dets høje næringsværdi4. Det er en god kilde til protein, fiber, mineraler og phenolantioxidanter, såsom chlorogen syre5. Da det kan formales til pulver og anvendes i bageprodukter eller indtages i drikkevarer, har nylige undersøgelser evalueret inkorporeringen af Ramón-frømel (RSF) i forskellige fødevarer for at forbedre deres næringsværdi. En RSF-suppleret cappuccino-aromatiseret drik blev formuleret, som var høj i kostfiber og havde mere end 6 g protein pr. Portion og blev meget accepteret af forbrugerne; det blev således betragtet som et potentielt alternativ til at opfylde særlige kostbehov6. I en opfølgende undersøgelse blev RSF også brugt til at formulere en muffin og en ny drik rig på protein, kostfiber, mikronæringsstoffer og phenolantioxidanter. Muffin og drik blev brugt i en diætintervention for ældre personer, der indtog begge produkter to gange om dagen i 30 dage. Efter denne periode blev deltagernes ernæringsmæssige og sarkopeniske status forbedret, og det samlede phenolindhold i plasma steg7. Bestemmelsen af totale phenolforbindelser i plasma blev imidlertid udført ved en spektrofotometrisk metode, så identifikation af de faktiske phenolforbindelser, der blev absorberet, var ikke mulig; Desuden er denne metode ikke helt specifik for phenolforbindelser, så der kan forekomme en vis overvurdering8.
Identifikation og kvantificering af phenolforbindelserne, der absorberes efter indtagelse af fødevarer, der er rige på disse antioxidanter, er en vanskelig opgave, men er nødvendig for at demonstrere den biologiske aktivitet af disse fytokemikalier. Biotilgængeligheden af de fleste phenolforbindelser er lav; mindre end 5% af dem kan findes uden strukturel transformation i plasma. Phenolforbindelser gennemgår flere biotransformationer, såsom methylering, sulfonering eller glucuronidation, som udføres af enterocytter og hepatocytter9. Fenolforbindelser biotransformeres også af mikrobiotaen til bakterielle katabolitter, der kan udøve deres gavnlige virkninger i kroppen efter at være blevet absorberet i plasmaet10. For eksempel er phenyleddikesyre et produkt af bakteriel transformation af flavonoider og oligomere proanthocyanidiner, som kan hæmme op til 40% af bakteriernes (Escherichia coli) vedhæftning i urinvejene efter tranebærforbrug11.
Den strukturelle mangfoldighed af naturligt forekommende phenolforbindelser, tilsat mangfoldigheden af deres metabolitter og deres lave biotilgængelighed, gør deres identifikation i plasma endnu mere udfordrende. Metabolomisk profilering ved hjælp af spektroskopiske analyseplatforme som nuklear magnetisk resonans (NMR) og tandemmassespektroskopi (MS / MS) er sandsynligvis den bedste tilgang til at nå dette mål; Desværre er udstyret ikke let tilgængeligt, og udviklingen af analyseprotokoller er stadig begrænset12. Flere undersøgelser har rapporteret MS/MS kombineret med et separationssystem (såsom væskekromatografi) som en strategi til at reducere kompleksiteten af massespektre i metabolomiske undersøgelser. Den nylige introduktion af UPLC-separationsmetoder (ultra-high-performance liquid chromatography) har reduceret analysetiden og øget opløsningen og følsomheden sammenlignet med konventionelle højtydende væskeprotokoller, så UPLC-MS/MS-systemer er hurtigt blevet bredt accepteret af det analytiske metabolomics-samfund13. På denne måde har nogle undersøgelser undersøgt phenolmetabolitter og påvist glucuroniderede derivater fra koffeinsyre, quercetin og ferulinsyre samt sulfonerede derivater fra syringinsyre og vanillsyre i plasmaet hos individer efter tranebærindtagelse14. Tidligere protokoller har haft til formål at finde phenolforbindelser og phenolmetabolitter i biofluider såsom plasma. Disse protokoller var baseret på identifikation og kvantificering ved hjælp af højtydende væskekromatografi (HPLC) koblet til en UV-vis-detektor15. Ikke desto mindre kræver sådanne protokoller anvendelse af autentiske standarder til vurdering af absolut identifikation og nøjagtig kvantificering. En lang række undersøgelser har identificeret de mest almindelige metabolitter i biofluider (sulfonerede, glucuroniderede og methylerede former) af UPLC-MS og UPLC-MS / MS; En stor del af bakteriemetabolitterne er imidlertid ikke blevet indberettet på grund af manglen på databaser, der indeholder deres fuldstændige oplysninger16. Identifikation af metabolit kompliceres af omkostningerne ved og den kommercielle tilgængelighed af metabolitstandarder. Derfor kan den bedste strategi være ikke-målrettet eller semi-målrettet MS/MS-metabolitanalyse, som er afhængig af anvendelsen af molekylær funktionsinformation (m/z, monoisotopisk nøjagtig masse, isotopisk fordeling og fragmenteringsmønster) til at bestemme den kemiske identitet og sammenligne den med frit tilgængelige onlinedatabaser, der indeholder polyphenolmetabolitter identificeret i biofluider efter indtagelse af polypolyphenol-richts12 . De vigtigste databaser, der anvendes i UPLC-MS / MS-undersøgelser til identifikation af phenolforbindelser og deres metabolitter, er Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library og andre komplementære databaser, såsom PubChem, ChemSpider og Phenol Explorer17.
I den foreliggende undersøgelse blev der udviklet en semi-målrettet UPLC-MS/ MS-metode til at analysere plasmaprøverne fra gruppen af ældre personer, der var involveret i rsf-holdigt muffin- og drikkevareforbrugsstudie7. Data fra forskellige gratis online databaser over plasmametabolitter blev indsamlet og integreret i en specialiseret database. Denne database kan tilgås automatisk af udstyrssoftwaren til at identificere de polyfenoliske metabolitter i de fem plasmaprøver før og efter den 30-dages ernæringsmæssige intervention. Dette gøres for at identificere de vigtigste phenolforbindelser eller deres metabolitter, der absorberes fra de specielt formulerede funktionelle fødevarer designet til forebyggelse af sarkopeni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Plasmaprøverne, der blev anvendt i denne protokol, blev indsamlet i en tidligere undersøgelse efter alle de etiske retningslinjer og godkendt af Institutional Ethics and Bioethics Committee (CIEB-2018-1-37) fra Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Den komplette protokol til ekstraktion og identifikation af phenolforbindelser og metabolitter i plasma ved UPLC-MS/MS er repræsenteret i figur 1.
Figur 1: Skematisk gengivelse af ekstraktion og identifikation af phenolforbindelser og metabolitter i plasma ved hjælp af den semi-målrettede UPLC-MS/MS-metode. Klik her for at se en større version af denne figur.
1. Prøveforberedelse
- Plasmaprøverne opbevares ved -80 °C indtil analysen.
- Optø plasmaprøverne ved stuetemperatur i 15 minutter.
BEMÆRK: Prøverne kan placeres i et vandbad ved 37 °C for at fremskynde processen (5 min.). - Anbring 200 μL plasmaprøve i et 2 ml mikrorør og bland med 1.000 μL ren ethanol. Vortex plasmaprøven i 30 s.
BEMÆRK: Brug altid handsker, når du arbejder med plasmaprøver. - Prøven centrifugeres ved 6.580 x g i 5 min. Efter centrifugering opsamles supernatanten med en mikropipette eller Pasteur-pipette og anbringes i et nyt mikrorør. Opbevar supernatanten ved 4 °C.
- Bland pelleten fra det foregående trin med 1.000 μL 100% ethanol, hvirvel i 30 s og derefter centrifuge ved 6.580 x g i 5 minutter.
BEMÆRK: Pillen er stærkt pakket og skal resuspenderes godt for at sikre kontakt mellem prøven og ren ethanol. Brug af en mikropipette til at skylle pillen med ethanol anbefales. - Efter centrifugering opsamles supernatanten og blandes med supernatanten, der tidligere er opnået fra trin 1.4. i et 2 ml mikrorør.
- Ethanol fjernes fra prøven ved anvendelse af rent nitrogen (99,997 %) ved 135 psi. Hold nålen 1 cm væk fra toppen af mikrorøret for at forhindre tab af prøver og skylning, indtil prøven er tør. Ingen varme er nødvendig for at fordampe ethanolen.
BEMÆRK: Kvælstofstrømmen skal være lav for at forhindre tab af prøver. Når ethanolen er tørret, skal kvælstofstrømmen holdes i mindst 5 minutter for at sikre prøvens tørhed. Protokollen kan sættes på pause på dette tidspunkt; Prøverne skal opbevares ved -20 °C. Undgå at opbevare prøverne i mere end 12 timer. - De tørre prøver suspenderes i 100 μL af en blanding af acetonitril: vand i en andel på 50:50 (v:v).
- Filtrer prøven gennem en 0,45 μm nylonsprøjtemembran direkte i en HPLC hætteglas mikroindsats.
BEMÆRK: Prøverne i hætteglasset kan opbevares ved -20 °C inden analyse. Opbevar prøverne i højst 8 timer. Det anbefales at injicere prøverne i UPLC-systemet lige efter filtrering.
2. UPLC-MS/MS-analyse
- 3 μL prøve injiceres på en UPLC udstyret med en C18-søjle med omvendt fase (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Indstil autosamplertemperaturen til 20 °C og søjletermostaten til 25 °C. Injektion af hver prøve i tre eksemplarer.
- Brug 0,1% (v:v) myresyre i vand som opløsningsmiddel A og 100% acetonitril som opløsningsmiddel B. Indstil strømningshastigheden til 0,4 ml/min og et gradientprogram som følger: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (tabel 1).
- Indstil massespektrometeret til ionisering i negativ tilstand. Brug nitrogen som tørregas ved 340 °C og en strømningshastighed på 13 L/min. Indstil forstøvertrykket til 60 psi. Indstil kapillærspændingen til 4.000 V, fragmentorspændingen til 175 V og Skimmerspændingen til 65 V. Brug kollisionsenergi ved 20 V (tabel 2).
- Scan masserne mellem 100-1100 masse til ladningsforhold (m/z), og scan for MS/MS masser mellem 50-1000 m/z (tabel 2). Indstil dataindsamling til Auto MS/MS-tilstand. Brug følgende referencemasse: 119.036 og 966.0007.
| Tidspunkt (min) | Opløsningsmiddel A (0,1 % myresyre i HPLC-vand) | Opløsningsmiddel B (100 % acetonitril) |
| 0 til 1 | 90 | 10 |
| 1 til 4 | 70 | 30 |
| 4 til 6 | 62 | 38 |
| 6 til 8 | 40 | 60 |
| 8 til 8.5 | 40 | 60 |
| 8.5 til 9 | 90 | 10 |
Tabel 1: Mobil fasegradient anvendt til adskillelse af phenolforbindelser ved UPLC.
| Ioniseringstilstand | Negativ |
| Tørring af gas | Kvælstof ved 340 °C, strømningshastighed 13 L/min |
| Forstøver tryk | 60 psi |
| Kapillær spænding | 175 V |
| MS-scanningsmasser | 100-1100 m/z |
| MS/MS-scanningsmasser | 50-1000 m/z |
Tabel 2: Ioniseringsparametre for MS/MS-analysen.
3. Database konstruktion
- Søg efter phenolforbindelser, phenolmetabolitter eller andre forbindelser af interesse i den videnskabelige litteratur.
- Åbn databasestyringssoftwaren, der er inkluderet i UPLC-systemet. Vælg | Nyt PCDL-| (Personal Database Compound Library) Opret ny PCDL. Vælg typen af PCDL: LC/MS Metabolomics. Angiv et navn til PCDL. Vælg derefter Opret.
- På værktøjslinjen skal du vælge PCDL og derefter indstillingen Tillad redigering . Klik derefter på knappen Find forbindelser .
BEMÆRK: Da det er en ny PCDL, vil tabelresultaterne være tomme. Dette vil ændre sig, når nye forbindelser tilsættes til PCDL.- Tilføj forbindelser til det specialiserede personlige databaseforbindelsesbibliotek ved at kopiere dem fra instrumentets generelle bibliotek. Åbn instrumentets eksisterende database, der er inkluderet i databasestyringssoftwaren. Klik på knappen Find forbindelser. I indstillingen Enkelt søgning skal du indtaste de sammensatte søgekriterier for at finde interesseforbindelsen.
BEMÆRK: Forbindelser kan findes ved navn, molekylformel, nøjagtig masse og retentionstid. - Vælg renteforbindelsen i tabellen med sammensatte resultater. Hvis du vil vælge mere end én forbindelse, skal du klikke på den første forbindelse, holde CTRL-tasten nede og derefter klikke på hvert interesseelement. Højreklik derefter på alle de fremhævede forbindelser, og vælg Føj til PCDL.
- I det nye vindue skal du søge og vælge den specialiserede personlige databasefil. Markér felterne Medtag spektre for forbindelser, hvis de er til stede, og Inkluder oplysninger om ionmobilitet for forbindelser, hvis de findes. Klik på knappen Tilføj . Vælg Ja i den nye dialogboks for at markere de nye forbindelser, der er tilføjet. Vælg Nej for at fortsætte med at søge efter flere forbindelser af interesse.
- Tilføj forbindelser til det specialiserede personlige databaseforbindelsesbibliotek ved at kopiere dem fra instrumentets generelle bibliotek. Åbn instrumentets eksisterende database, der er inkluderet i databasestyringssoftwaren. Klik på knappen Find forbindelser. I indstillingen Enkelt søgning skal du indtaste de sammensatte søgekriterier for at finde interesseforbindelsen.
- Hvis de interessante forbindelser ikke er tilgængelige i instrumentets generelle bibliotek, skal du tilføje nye forbindelser manuelt.
- Åbn den specialiserede personlige database. Når den er åbnet, skal du følge trin 3.3. Vælg indstillingen Rediger forbindelser . Klik på knappen Tilføj ny .
- I den øverste del af vinduet skal du udfylde oplysningerne om den nye forbindelse. Udfyld formlen, navnet, IUPAC-navnet, CAS-nummeret, Chemspider-id'et og andre identifikatorer.
- Brug de tilgængelige oplysninger i de gratis online biblioteker (Chemspider, PubChem og Phenol Explorer) til at udfylde oplysningerne for den nye forbindelse af interesse. Når du er færdig, skal du klikke på knappen Gem som ny for at gemme de nye sammensatte oplysninger i den specialiserede personlige database.
BEMÆRK: Når du tilføjer oplysninger fra gratis biblioteker, skal du sørge for at medtage de sammensatte oplysninger uden tilstedeværelse af chlorid- eller iodidioner. Dette kan ændre den nøjagtige masse og molekylformel for den pågældende forbindelse.
- Gentag processen med alle forbindelser af interesse for at fuldføre den specialiserede personlige database.
4. Analyse af data
- Brug instrumentets kvalitative ledelsessoftware til at identificere de phenolforbindelser og phenolmetabolitter, der er til stede i prøverne.
- Åbn eksempelfilen. I panelet Kromatogram skal du vælge Definer kromatogrammer og udtrække det samlede ionkromatogramme (TIC), det ekstraherede ionkromatogram af MS (EIC) og EIC for MS/MS. Vælg indstillingen integrer kromatogram.
- Vælg Find efter formelindstillinger i panelet Find forbindelser. I det nye vindue skal du vælge Formelkilde og derefter indstillingen Database/bibliotek. Find den personlige database, der tidligere er oprettet, og klik på Åbn.
- Vælg indstillingen Formelmatchning, og angiv en massematchtolerance på 5 dele pr. million (ppm).
BEMÆRK: En anden matchtolerance for masser kan indstilles til 10 ppm; denne forskel afhænger af det anvendte massespektrometer. - Vælg indstillingen Negative ioner, og vælg kun dialogboksen -H . I indstillingen Resultater skal du markere dialogboksene Uddrag EIC, Udtræk renset spektrum, Udtræk råspektrum og medtage struktur .
- Vælg indstillingen Resultatfiltre . Marker Advar, hvis scoren er , og indstil scorekampen til 80,00%. Markér Ikke match, hvis scoren er , og indstil scoren til 75,00%.
BEMÆRK: Match/not match-scorerne kan ændres til lavere værdier, hvis det er nødvendigt. Dette vil reducere nøjagtigheden af identifikationen. - Klik på Find forbindelser efter formel for at identificere forbindelser af interesse i prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den trinvise proces til identifikation af phenolmetabolitter gennem den semi-målrettede UPLC-MS/MS-analyse i negativ tilstand af plasmaprøver er afbildet i figur 2. For det første blev det totale ionkromatogramme (TIC) fra plasmafenolekstraktet (opnået efter proteinudfældning af den samlede plasmaprøve) opnået gennem instrumentets kvalitative software. Derefter blev det ekstraherede ionkromatogram anvendt, og det nøjagtige masse- og fragmenteringsmønster (MS / MS-analyse) af hvert signal (eller molekylært træk) blev sammenlignet med dem i en bestemt personlig database, der også blev oprettet i instrumentets software. Signaler med en massematch på mindre end 5 ppm blev tildelt en molekylformel fra databasen. Endelig blev isotopfordelingen af hvert signal sammenlignet med fordelingen af den tildelte molekylformel for at opnå den endelige foreløbige identifikation. Forbindelser, der a) kun blev identificeret i en replikat eller b) præsenterede et område lavere end 10.000, blev behandlet som falske identifikationer. Ud fra denne analyse blev i alt 25 phenolforbindelser og metabolitter identificeret i plasmaprøverne (tabel 3). På denne liste blev der fundet både phenolforbindelser og deres metabolitter, såsom 3-hidroxyphenylvalerinsyre og isopropyl 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoat. Da den negative ioniseringstilstand er bedst egnet til alle klasser af phenolforbindelser, undtagen anthocyaniner, kunne disse forbindelser ikke påvises med den nuværende metode. Hvis anthocyaniner er vigtige komponenter i fødevarematrixen, bør den positive tilstand også anvendes.
| Fenolmetabolitter | R.T. (min) | Formel | Forløber | Eksperimentel masse | Den meniske masse | Forskel (ppm) | |
| 2,3-Dihydroxybenzoesyre | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-Hydroxyhippurinsyre | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-Dihydroxytoluen | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-Hydroxyphenylvalerinsyre | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-dihydroxyphenyl)-valerinsyre | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Hydroxyenterodiol | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Ajugol | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Benzoesyre | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Carnosinsyre | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Carnosol | 6.347 | C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Katekiol | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Glycitin | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Hesperetin | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Hippursyre | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Homovanilsyre | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| Isopropyl 3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoat | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Phenyleddikesyre | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Phloretinsyre | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Protocatechuisk aldehyd | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinol | 8.837 | C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Vanillin | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Epicatechin 3'-O-glucuronid | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Gomisin M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| Irisolidon | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Urolithin C | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Tabel 3: Foreløbig identifikation af phenolforbindelser og metabolitter i plasmaprøver ved hjælp af den semi-målrettede UPLC-MS/MS-metode.
For at evaluere effektiviteten af den designede metode til identifikation af de vigtigste phenolforbindelser eller deres metabolitter, der blev absorberet fra den RSF-holdige muffin og drik, blev fem aleatoriske prøver af undersøgelsesdeltagerne, opnået før og efter 30-dages interventionen, analyseret. Den relative forekomst af hver forbindelse blev beregnet ved at dividere arealet under kurven (AUC) efter behandling af AUC før behandling. Fra denne analyse var det muligt at observere, at nogle forbindelser kun optrådte i prøverne opnået før behandlingen, andre forblev uændrede, mens nogle af dem steg efter indtagelse af de funktionelle fødevarer. Tabel 4 viser listen over 12 phenolforbindelser, der viste en stigning i plasma efter 30-dages forbrug af de RSF-holdige fødevarer. Phenyleddikesyre var den eneste metabolit, der blev fundet konsekvent i højere koncentrationer efter behandlingen. Glycitin, en glycosyleret isoflavon og 3-hydroxyphenylvalerinsyre (en phenolmetabolit) steg i tre af de fem prøver, men faldt i de to andre. Gomisin M2, en lignan, blev først påvist i tre af de fem prøver efter ernæringsinterventionen. De andre phenolforbindelser (såsom hesperetin, secoisolariciresinol og vanillin) og metabolitter (såsom 2-hydroxyhippursyre) blev kun fundet i en prøve og først efter behandlingen.
| Prøve (AUC efter treatmet/AUC før behandling) | |||||||
| Forbindelse | Formel | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-Hydroxyhippurinsyre | C18H33NO4 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| 3-Hydroxyphenylvalerinsyre | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Hydroxyenterodiol | C18H22O5 | Nd | Nd | T | Nd | Nd | |
| Glycitin | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Hesperetin | C16H14O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Phenyleddikesyre | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Phloretinsyre | C9H10O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Protocatechuisk aldehyd | C7H6O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Secoisolariciresinol | C20H26O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Vanillin | C8H8O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Gomisin M2 | C22H26O6 | Nd | T | T | T | Nd | |
Tabel 4: Liste over phenolforbindelser, der steg i plasmaet hos ældre individer efter 30-dages forbrug af RSF-holdige fødevarer. Data er forholdet mellem overflod (AUC) af hver forbindelse efter behandling sammenlignet med deres overflod før behandlingen. T indikerer, at forbindelsen først blev identificeret i prøven efter behandlingen. Nd: ikke registreret.
Figur 2: Protokol til identifikation af phenolforbindelser metabolitter ved hjælp af semi-målrettede UPLC-MS/MS. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Identifikation og kvantificering af de bioaktive fytokemikalier, der absorberes efter indtagelse af en fødevare eller et kosttilskud, er afgørende for at påvise og forstå de sundhedsmæssige fordele ved disse forbindelser og de fødevarer, der indeholder dem. I det foreliggende arbejde blev UPLC-MS/MS-metoden udviklet, der kun havde til formål at identificere de vigtigste phenolforbindelser og deres metabolitter, der steg i koncentration i plasma efter en 30-dages ernæringsmæssig intervention med to fødevarer, der er specielt formuleret til ældre. Det blev antaget, at hvis en forbindelse først steg eller forekom i plasma efter interventionsperioden, var denne forbindelse blevet absorberet og/eller biotransformeret fra de fødevarer, der blev anvendt i interventionen.
UPLC-MS/MS er en af de foretrukne teknologier til metabolomiske undersøgelser, hvor mange forbindelser med lav molekylvægt analyseres samtidigt i komplekse prøver for at vurdere effekten af en eller anden behandling eller miljøændring13. Dette kan gøres gennem målrettede og ikke-målrettede (eller globale) metoder. Målrettede analyser fokuserer på et kendt, lille antal metabolitter af interesse. De er den bedste mulighed for at kvantificere forbindelser med tilgængelige standarder, hvilket giver den bedste specificitet og følsomhed; Disse metoder skal imidlertid optimeres grundigt for de udvalgte metabolitter og er ude af stand til at påvise uventede forbindelser i prøverne12. I andre undersøgelser er HPLC kombineret med en UV-vis-detektor blevet anvendt til at identificere phenolsyrer og metabolitter i plasma, men denne type undersøgelse har anvendt analytiske standarder til at identificere og kvantificere forbindelsen af interesse15. I en anden undersøgelse blev tilføjelsen af en intern standard foreslået18; dog blev kun ferulinsyre og koffeinsyrer og deres metabolitter analyseret i dette arbejde. På den anden side er syntesen af interne standarder for phenolmetabolitter blevet foreslået som et alternativ til manglen på kommercielle analysestandarder19. Ikke desto mindre er syntesen af et stort udvalg af phenolforbindelser vanskelig, tidskrævende og dyr. Ikke-målrettede metoder forsøger at detektere og identificere så mange molekylære forbindelser som muligt og er primært hypotesegenererende12. De kan identificere flere hundrede forbindelser i en prøve ved at tildele formler til detekterbare kromatografiske signaler med karakteristiske træk, såsom m/z eller målt nøjagtig masse, kromatografisk retentionstid, isotopisk fingeraftryk osv., så de data, der genereres af disse analyser, er meget rigelige og kan være vanskelige at fortolke20 . Da formålet med denne metode ikke var at opnå en fuld metabolisk profil af plasmaprøverne (hvilket ville være en ikke-målrettet tilgang), men at identificere de vigtigste phenolforbindelser og phenolmetabolitter (tidligere ukendte) i dem, blev der designet en semi-målrettet tilgang. Til dette blev alle de identificerede signaler ekstraheret automatisk med instrumentets software og derefter sammenlignet med en selvoprettet database, der indeholdt 645 phenolforbindelser og deres metabolitter, som blev opnået fra gratis online databaser. Databasen indeholdt reference-MS/MS-fragmenteringsmønstre for de forbindelser, der blev anvendt til tildeling af det sammensatte navn og formel, hvilket giver mulighed for en mere nøjagtig identifikation af forbindelser i prøven12.
De mest kritiske trin i protokollen var 1) prøveforbehandling (ekstraktion og koncentration af phenolforbindelser og metabolitter fra plasmaprøver); 2) opbygning af en komplet og specifik database til semi-målrettet analyse af prøverne og identifikation af alle mulige forbindelser, der tilhører en bestemt sammensat klasse og 3) udvælgelsen af de parametre, der anvendes af instrumentets kvalitative software (massematchtolerance ppm og score%) til nøjagtigt at identificere forbindelserne i prøven. Ved prøveforbehandling skal der udvises forsigtighed for at undgå tab af de interessante forbindelser, genvinde dem ved en høj slutkoncentration og være i stand til at eliminere interfererende forbindelser. I forbindelse med oprettelsen af den specifikke database er det afgørende at foretage en grundig litteratursøgning og derefter bruge gratis online databaser til at indhente specifikke kemiske data, der vil blive brugt til identifikation af forbindelser i prøven. Udvælgelsen af de bedste værdier for massematch og score krævede forudgående validering af analysemetoden ved hjælp af standarder og kendte prøver21,22.
Når protokollen var implementeret, var de almindelige problemer og deres anbefalede løsninger følgende: 1) Ingen forbindelser blev identificeret i prøverne. Dette skyldtes den lave koncentration af forbindelserne og kunne løses ved at tørre prøven og opløse den igen i et mindre volumen. 2) Signaler optrådte i TIC, men forbindelser blev ikke identificeret. Dette kan skyldes en fejl i massekalibrering, så forskellen mellem eksperimentelle og teoretiske masser var høj. I dette tilfælde skal instrumentets massekalibrering udføres i henhold til udstyrets producent og model. En anden grund kan være en ufuldstændig personlig database, så det er vigtigt at konstant kontrollere og vedligeholde databasen. Masser af forbindelser, der mistænkes for at være af interesse, kan kontrolleres og sammenlignes med frit tilgængelige onlinedatabaser eller ny videnskabelig litteratur. 3) Signaler optrådte i tomme kørsler. Dette indikerer forurening og kan løses ved at rengøre autosamplernålen og søjlen. Standard rengøringsprotokollen er at udføre nogle kørsler ved hjælp af methanol, derefter isopropanol og til sidst acetonitril som den mobile fase. Derefter udlignes kolonnen igen og kører den mobile fase i mindst 30 minutter.
De største vanskeligheder ved udviklingen af denne form for metode er 1) den lave biotilgængelighed generelt af alle fytokemikalier, herunder phenolforbindelser, hvilket svarer til meget lave plasmakoncentrationer16; 2) den store mangfoldighed af phenolforbindelser, der er til stede i fødevarer, som øges ved deres metabolisme og biotransformation, der forekommer i humane enterocytter og hepatocytter og kolonmikrobiotaen23; 3) manglen på standarder (nogle standarder findes, men er meget vanskelige at opnå) for mange forbindelser, især for metabolitterne, og eksistensen af nogle ukendte eller ukarakteriserede forbindelser23; og 4) variable responser blandt individer, både i absorption og metabolisme af fytokemikalier14. For at overvinde problemet med lave plasmakoncentrationer af phenolmetabolitter bør de ekstraheres og koncentreres. Dette kan opnås ved mikro-fastfaseekstraktion14 eller, som i det foreliggende arbejde, ved tilsætning af opløsningsmidler, der udfælder proteiner og opløser phenolforbindelser og metabolitter, efterfulgt af opløsningsmiddelfordampning og resuspension i et mindre volumen19. Denne teknik er enkel, økonomisk og tilstrækkelig til et lille antal prøver. Imidlertid kunne genvindingen af forbindelser af interesse let forbedres ved at anvende større plasmavolumener, så den endelige koncentration af alle forbindelserne ville være højere. Den store mangfoldighed af phenolmetabolitter og manglen på standarder er grunden til, at en semi-målrettet tilgang blev brugt til at identificere de forbindelser, der blev øget ved interventionen, før man forsøgte at kvantificere dem. Ved at bruge en specielt oprettet database i stedet for en helt umålrettet analyse var det muligt at ignorere de mange primære metabolitter i plasma, idet der kun fokuseres på phenolforbindelserne og deres metabolitter. En vigtig begrænsning af denne database, der er specifik for phenolforbindelser og deres humane metabolitter, var manglen på massespektral information for mange forbindelser og deres metabolitter, hvilket reducerer nøjagtigheden af forbindelsesidentifikationen.
Stor variabilitet blandt individer observeres regelmæssigt i undersøgelser, der evaluerer absorption og metabolisme af phenolforbindelser, både kvantitativt og kvalitativt. I de foreliggende resultater præsenterede et individ 18 forbindelser i plasmaprøven taget efter interventionen, mens de andre kun viste 9 eller 10. Desuden blev mange phenolforbindelser og metabolitter kun fundet i baselineprøverne (før interventionen), og de varierede også mellem individer. Samlet set viste mere end halvdelen af de identificerede forbindelser højere koncentrationer (AUC) før end efter interventionen eller blev kun fundet i prøverne før interventionen. Derfor var det nødvendigt at sammenligne individuelle prøver taget før og efter interventionen for at forstå, hvilke forbindelser der faktisk blev øget af den. Den eneste metabolit, der konsekvent steg efter behandlingen, var phenyleddikesyre, en mikrobiel katarolit af flavan-3-ols24, der er fundet i plasmaet hos enkeltpersoner i akutte undersøgelser af forbruget af phenolrige fødevarer14,25. De fleste af de undersøgelser, der har identificeret og kvantificeret phenolmetabolitter i plasma, var akutte undersøgelser, hvor de sammensatte koncentrationer blev overvåget i løbet af de 24 timer efter indtagelse af det phenolrige måltid, idet de observerede, at deres koncentrationer efter 24 timer var nær basalværdien19,25. Derfor er det forståeligt, at de prøver, der blev analyseret i det nuværende arbejde, viste lave tal og koncentrationer af phenolmetabolitter. For nylig evaluerede Zhang et al.25 forbruget af rød hindbær, både i akutte undersøgelser og efter 4 ugers tilskud. De observerede, at både akutte og kroniske indgreb øgede phenolforbindelser og deres metabolitter, mens den basale plasmakoncentration af nogle metabolitter efter 4-ugers tilskud steg (urolithiner, kanelsyre, phenylpropionsyre og hippursyrer) og af andre faldt (konjugerede anthocyaninderivater).
En afsluttende undersøgelse af den metode, der er udviklet i dette papir, viser, at den i de fleste dele var velegnet til det mål, som den blev oprettet til. Prøveforbehandlingen var enkel og effektiv, og UPLC-separationen og semi-målrettet MS/MS-identifikation af phenolmetabolitter blev opnået. Denne semi-målrettede metode kan være nyttig som en første screeningsmetode til at identificere phenolforbindelser, der kan absorberes fra forskellige fødevarematrixer, såvel som de phenolmetabolitter, der er til stede i humant plasma. Desuden er protokollen nyttig, fordi den tillader identifikation, når der ikke findes standarder fra phenolforbindelser eller metabolitter. Endelig anvender metoden en lille plasmamængde, hvilket er kritisk i de fleste in vivo-studier , hvor plasmaprøver er knappe. Det anbefales dog, at der i forbindelse med fremtidige undersøgelser foretages en akut undersøgelse inden den kroniske intervention for bedre at identificere de vigtigste phenolforbindelser og metabolitter, der absorberes fra de specielt formulerede fødevarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Forfatterne er taknemmelige for den økonomiske støtte fra CONACYT, Mexico (CB- 2016-01-286449) og UACJ-PIVA (projekt 313-17-16 og 335-18-13). OAMB ønsker at takke CONACYT for hans ph.d.-stipendium. Teknisk support fra Multimedia Production-kontoret fra UACJ er taknemmeligt anerkendt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A.
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
