Summary
Het doel van dit protocol is om fenolische metabolieten in plasma te detecteren met behulp van een semi-gerichte chromatografie-massaspectrometriemethode.
Abstract
Een groep van 23 ouderen kreeg functionele maaltijden (een drankje en een muffin) speciaal samengesteld voor de preventie van sarcopenie (leeftijdsgebonden verlies van spiermassa). Plasmamonsters werden genomen aan het begin van de interventie en na 30 dagen na het nuttigen van de functionele maaltijden. Een semi-gerichte ultra-high-performance chromatografie in combinatie met tandemmassa (UPLC-MS/MS) analyse werd uitgevoerd om fenolverbindingen en hun metabolieten te identificeren. Plasma-eiwitten werden neergeslagen met ethanol en de monsters werden geconcentreerd en geresuspendeerd in de mobiele fase (1:1 acetonitril: water) voor injectie in het UPLC-MS/MS-instrument. Scheiding werd uitgevoerd met een C18 omgekeerde fase kolom, en verbindingen werden geïdentificeerd met behulp van hun experimentele massa, isotopische verdeling en fragmentpatroon. Samengestelde factoren van belang werden vergeleken met die van databanken en de interne semi-gerichte bibliotheek. Voorlopige resultaten toonden aan dat de belangrijkste metabolieten die na de interventie werden geïdentificeerd fenylazijnzuur, glycitine, 3-hydroxyfenylvalerinezuur en gomisine M2 waren.
Introduction
Sarcopenie is een progressieve skeletaandoening gerelateerd aan een versneld spierverlies bij de oudere bevolking. Deze aandoening verhoogt het risico op vallen en leidt tot beperkte activiteiten van het dagelijks leven. Sarcopenie is aanwezig bij ongeveer 5%-10% van de personen ouder dan 65 jaar en ongeveer 50% van de personen van 80 jaar of ouder1. Er zijn geen specifieke geneesmiddelen goedgekeurd voor de behandeling van sarcopenie, dus preventie met fysieke activiteit en een uitgebalanceerd dieet is belangrijk1,2. Voedingsinterventies met speciaal samengestelde voedingsmiddelen verrijkt met zuiveleiwitten en essentiële aminozuren hebben positieve resultaten laten zien bij het voorkomen van sarcopenie2. In andere studies hebben auteurs vitamines en antioxidanten, zoals vitamine E en isoflavonen, in het dieet opgenomen, waardoor de voordelen voor spiergroei op de taille en heupen toenemen3.
Brosimum alicastrum Sw. (Ramón) is een boom die groeit in de Mexicaanse tropische gebieden; het is geconsumeerd door Maya-culturen vanwege de hoge voedingswaarde4. Het is een goede bron van eiwitten, vezels, mineralen en fenolische antioxidanten, zoals chlorogeenzuur5. Omdat het kan worden vermalen tot poeder en kan worden gebruikt in bakproducten of geconsumeerd in dranken, hebben recente studies de opname van Ramón-zaadmeel (RSF) in verschillende voedingsmiddelen geëvalueerd om hun voedingswaarde te verbeteren. Een RSF-aangevulde drank met cappuccino-smaak werd geformuleerd, die rijk was aan voedingsvezels en meer dan 6 g eiwit per portie bevatte, en zeer werd geaccepteerd door consumenten; het werd dus beschouwd als een potentieel alternatief om aan speciale dieetwensen te voldoen6. In een vervolgstudie werd RSF ook gebruikt om een muffin en een nieuwe drank te formuleren die rijk is aan eiwitten, voedingsvezels, micronutriënten en fenolische antioxidanten. De muffin en drank werden gebruikt in een dieetinterventie voor ouderen, die beide producten twee keer per dag gedurende 30 dagen consumeerden. Na deze periode verbeterde de voedings- en sarcopeenstatus van de deelnemers en nam het totale fenolgehalte van plasma toe7. De bepaling van de totale fenolverbindingen in plasma werd echter uitgevoerd met een spectrofotometrische methode, zodat identificatie van de werkelijke fenolverbindingen die werden geabsorbeerd niet mogelijk was; bovendien is deze methode niet volledig specifiek voor fenolverbindingen, dus enige overschatting kan optreden8.
Identificatie en kwantificering van de fenolverbindingen die worden geabsorbeerd na consumptie van voedingsmiddelen die rijk zijn aan deze antioxidanten is een moeilijke taak, maar is noodzakelijk om de biologische activiteit van deze fytochemicaliën aan te tonen. De biologische beschikbaarheid van de meeste fenolverbindingen is laag; minder dan 5% van hen kan worden gevonden zonder structurele transformatie in plasma. Fenolverbindingen ondergaan verschillende biotransformaties, zoals methylatie, sulfonatie of glucuronidering, die worden uitgevoerd door enterocyten en hepatocyten9. Fenolverbindingen worden ook door de microbiota biotransformeerd in bacteriële katabolieten die hun gunstige effecten in het lichaam kunnen uitoefenen nadat ze in het plasma zijn opgenomen10. Fenylazijnzuur is bijvoorbeeld een product van de bacteriële transformatie van flavonoïden en oligomere proanthocyanidinen, die tot 40% van de bacterie (Escherichia coli) adhesie in de urinewegen kunnen remmen na cranberryconsumptie11.
De structurele diversiteit van natuurlijk voorkomende fenolverbindingen, toegevoegd aan de diversiteit van hun metabolieten en hun lage biologische beschikbaarheid, maakt hun identificatie in plasma nog uitdagender. Metabolomische profilering, met behulp van spectroscopische analyseplatforms zoals nucleaire magnetische resonantie (NMR) en tandemmassaspectroscopie (MS / MS), is waarschijnlijk de beste aanpak om dit doel te bereiken; helaas is de apparatuur niet gemakkelijk toegankelijk en is de ontwikkeling van analyseprotocollen nog beperkt12. Verschillende studies hebben MS/MS in combinatie met een scheidingssysteem (zoals vloeistofchromatografie) gerapporteerd als een strategie om de complexiteit van massaspectra in metabolomische studies te verminderen. De recente introductie van ultra-high-performance vloeistofchromatografie (UPLC) scheidingsmethoden heeft de analysetijd verkort en de resolutie en gevoeligheid verhoogd in vergelijking met conventionele high-performance vloeistofprotocollen, zodat UPLC-MS / MS-systemen snel algemeen zijn geaccepteerd door de analytische metabolomics-gemeenschap13. Op deze manier hebben sommige studies fenolmetabolieten onderzocht en glucuronideerde derivaten van cafeïnezuur, quercetine en ferulazuur gedetecteerd, evenals gesulfoneerde derivaten van syringine en vanillinezuur in het plasma van individuen na cranberry-inname14. Eerdere protocollen waren bedoeld om fenolverbindingen en fenolische metabolieten te vinden in biofluïden zoals plasma. Deze protocollen waren gebaseerd op identificatie en kwantificering door middel van high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) gekoppeld aan een UV-vis detector15. Niettemin vereisen dergelijke protocollen het gebruik van authentieke normen om absolute identificatie en nauwkeurige kwantificering te beoordelen. Een breed scala aan studies heeft de meest voorkomende metabolieten in biofluïden (gesulfoneerde, geglucuronideerde en gemethyleerde vormen) door UPLC-MS en UPLC-MS / MS geïdentificeerd; een groot deel van de bacteriële metabolieten is echter niet gemeld vanwege het ontbreken van databases die hun volledige informatie bevatten16. De identificatie van metabolieten wordt bemoeilijkt door de kosten en commerciële beschikbaarheid van metabolietnormen. Daarom kan de beste strategie ongerichte of semi-gerichte MS/MS-metabolietanalyse zijn, die afhankelijk is van het gebruik van moleculaire kenmerkinformatie (m/z, exacte mono-isotoopische massa, isotopische distributie en fragmentatiepatroon) om de chemische identiteit te bepalen en deze vergelijkt met vrij beschikbare online databases die polyfenolmetabolieten bevatten die in biofluïden zijn geïdentificeerd na de consumptie van polypolyfenol-richts12 . De belangrijkste databases die worden gebruikt in UPLC-MS /MS-studies voor de identificatie van fenolverbindingen en hun metabolieten zijn de Human Metabolome Database (HMDB), LipidBlast Library, METLIN Library en andere aanvullende databases, zoals PubChem, ChemSpider en Phenol Explorer17.
In deze studie werd een semi-gerichte UPLC-MS/MS-methode ontwikkeld om de plasmamonsters te analyseren van de groep ouderen die betrokken waren bij de RSF-bevattende muffin- en drankconsumptiestudie7. Gegevens uit verschillende gratis online databases van plasmametabolieten werden verzameld en geïntegreerd in een gespecialiseerde database. Deze database kan automatisch worden geopend door de software van de apparatuur om de polyfenolische metabolieten in de vijf plasmamonsters voor en na de 30-daagse voedingsinterventie te identificeren. Dit wordt gedaan om de belangrijkste fenolverbindingen of hun metabolieten te identificeren die worden geabsorbeerd uit de speciaal geformuleerde functionele voedingsmiddelen die zijn ontworpen voor de preventie van sarcopenie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De plasmamonsters die in dit protocol worden gebruikt, werden verzameld in een eerdere studie volgens alle ethische richtlijnen en goedgekeurd door de Commissie institutionele ethiek en bio-ethiek (CIEB-2018-1-37) van de Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Het volledige protocol voor de extractie en identificatie van de fenolverbindingen en metabolieten in plasma door UPLC-MS/MS is weergegeven in figuur 1.
Figuur 1: Schematische weergave van de extractie en identificatie van fenolverbindingen en metabolieten in plasma volgens de semi-gerichte UPLC-MS/MS-methode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
1. Monstervoorbereiding
- Bewaar de plasmamonsters bij -80 °C tot de analyse.
- Ontdooi de plasmamonsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
OPMERKING: De monsters kunnen in een waterbad bij 37 °C worden geplaatst om het proces te versnellen (5 min). - Plaats 200 μL plasmamonster in een microbuisje van 2 ml en meng met 1.000 μL zuivere ethanol. Vortex het plasmamonster gedurende 30 s.
OPMERKING: Gebruik altijd handschoenen bij het werken met plasmamonsters. - Centrifugeer het monster gedurende 5 minuten bij 6.580 x g . Verzamel na het centrifugeren het supernatant met een micropipette of Pasteur pipet en plaats het in een nieuwe microbuis. Bewaar het supernatant bij 4 °C.
- Meng de pellet uit de vorige stap met 1.000 μL 100% ethanol, vortex gedurende 30 s en centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 6.580 x g .
OPMERKING: De pellet is sterk verpakt en moet goed worden geresuspendeerd om contact tussen het monster en zuivere ethanol te garanderen. Het gebruik van een micropipette om de pellet met ethanol te spoelen wordt aanbevolen. - Verzamel na het centrifugeren het supernatant en meng met het supernatant dat eerder is verkregen uit stap 1.4. in een microbuisje van 2 ml.
- Verwijder ethanol uit het monster met zuivere stikstof (99,997%) bij 135 psi. Houd de naald op 1 cm afstand van de bovenkant van de microbuis om monsterverlies te voorkomen en spoel totdat het monster droog is. Er is geen warmte nodig om de ethanol te verdampen.
OPMERKING: De stikstofstroom moet laag zijn om monsterverlies te voorkomen. Zodra de ethanol is gedroogd, houdt u de stikstofstroom gedurende ten minste 5 minuten om de droogheid van het monster te garanderen. Het protocol kan op dit punt worden gepauzeerd; de monsters moeten bij -20 °C worden bewaard. Bewaar de monsters niet langer dan 12 uur. - Resuspend de droge monsters in 100 μL van een mengsel van acetonitril: water in een verhouding van 50:50 (v:v).
- Filtreer het monster door een nylon spuitmembraan van 0,45 μm rechtstreeks in een micro-inzetstuk van een HPLC-injectieflacon.
OPMERKING: De monsters in de injectieflacon kunnen vóór de analyse bij -20 °C worden bewaard. Bewaar de monsters niet langer dan 8 uur. Het wordt aanbevolen om de monsters net na filtratie in het UPLC-systeem te injecteren.
2. UPLC-MS/MS-analyse
- Injecteer 3 μL monster op een UPLC uitgerust met een C18 omgekeerde fase kolom (50 mm x 2,1 mm; 1,8 μm). Stel de autosamplertemperatuur in op 20 °C en de kolomthermostaat op 25 °C. Injecteer elk monster in drievoud.
- Gebruik 0,1% (v:v) mierenzuur in water als oplosmiddel A en 100% acetonitril als oplosmiddel B. Stel het debiet in op 0,4 ml/min en een gradiëntprogramma als volgt: 0-1 min 10% B, 1-4 min 30% B, 4-6 min 38% B, 6-8 min 60% B, 8-8,5 min 60% B, 8,5-9 min 10% B (tabel 1).
- Stel de massaspectrometer in op ionisatie in negatieve modus. Gebruik stikstof als drooggas bij 340 °C en een debiet van 13 L/min. Stel de vernevelingsdruk in op 60 psi. Stel de capillaire spanning in op 4.000 V, de fragmentorspanning op 175 V en de Skimmerspanning op 65 V. Gebruik botsingsenergie op 20 V (tabel 2).
- Scan de massa's tussen 100-1100 massa/ladingsverhouding (m/z) en, voor MS/MS, scan massa's tussen 50-1000 m/z (tabel 2). Stel gegevensverzameling in op de automatische MS/MS-modus. Gebruik de volgende referentiemassa: 119.036 en 966.0007.
| Tijd (min) | Oplosmiddel A (0,1 % mierenzuur in HPLC-water) | Oplosmiddel B (100 % acetonitril) |
| 0 tot 1 | 90 | 10 |
| 1 tot 4 | 70 | 30 |
| 4 tot 6 | 62 | 38 |
| 6 tot 8 | 40 | 60 |
| 8 tot 8,5 | 40 | 60 |
| 8,5 tot 9 | 90 | 10 |
Tabel 1: Mobiele fasegradiënt gebruikt voor de scheiding van fenolverbindingen door UPLC.
| Ionisatiemodus | Negatief |
| Gas drogen | Stikstof bij 340 °C, debiet 13 L/min |
| Vernevelaar druk | 60 psi |
| Capillaire spanning | 175 v |
| MS scan massa's | 100-1100 m/z |
| MS/MS scan massa's | 50-1000 m/z |
Tabel 2: Ionisatieparameters voor de MS/MS-analyse.
3. Database constructie
- Zoek naar fenolverbindingen, fenolische metabolieten of andere verbindingen van belang in de wetenschappelijke literatuur.
- Open de databasebeheersoftware die is opgenomen in het UPLC-systeem. Selecteer Bestand | Nieuwe PCDL-| (Personal Database Compound Library) Maak een nieuwe PCDL. Selecteer het type PCDL: LC/MS Metabolomics. Stel een naam in voor de PCDL. Selecteer vervolgens Maken.
- Selecteer op de werkbalk PCDL en vervolgens de optie Bewerken toestaan . Klik vervolgens op de knop Verbindingen zoeken .
OPMERKING: Aangezien het een nieuwe PCDL is, zijn de tabelresultaten leeg. Dit zal veranderen zodra nieuwe verbindingen aan de PCDL worden toegevoegd.- Voeg verbindingen toe aan de gespecialiseerde samengestelde bibliotheek voor persoonlijke databases door ze te kopiëren uit de algemene bibliotheek van het instrument. Open de bestaande database van het instrument die is opgenomen in de databasebeheersoftware. Klik op de knop Verbindingen zoeken. Voer in de optie Enkele zoekopdracht de samengestelde zoekcriteria in om de interessante samenstelling te vinden.
OPMERKING: Verbindingen kunnen worden gevonden op naam, molecuulformule, exacte massa en retentietijd. - Selecteer in de tabel met samengestelde resultaten de samengestelde factor van belang. Als u meer dan één samengestelde compound wilt selecteren, klikt u op de eerste samengestelde compound, houdt u CTRL ingedrukt en klikt u vervolgens op elke interessante compound. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op alle gemarkeerde verbindingen en selecteer Toevoegen aan PCDL.
- Zoek en selecteer in het nieuwe venster het gespecialiseerde persoonlijke databasebestand. Markeer de vakjes Spectra opnemen voor verbindingen indien aanwezig en Inclusief ionenmobiliteitsinformatie voor verbindingen indien aanwezig. Klik op de knop Toevoegen . Selecteer in het nieuwe dialoogvenster Ja om de nieuwe toegevoegde verbindingen te controleren. Selecteer Nee om te blijven zoeken naar meer interessante samenstellingen.
- Voeg verbindingen toe aan de gespecialiseerde samengestelde bibliotheek voor persoonlijke databases door ze te kopiëren uit de algemene bibliotheek van het instrument. Open de bestaande database van het instrument die is opgenomen in de databasebeheersoftware. Klik op de knop Verbindingen zoeken. Voer in de optie Enkele zoekopdracht de samengestelde zoekcriteria in om de interessante samenstelling te vinden.
- Als de interessante verbindingen niet beschikbaar zijn in de algemene bibliotheek van het instrument, voegt u handmatig nieuwe verbindingen toe.
- Open de gespecialiseerde persoonlijke database. Eenmaal geopend, volgt u stap 3.3. Selecteer de optie Verbindingen bewerken . Klik op de knop Nieuwe toevoegen .
- Vul in het bovenste gedeelte van het venster de informatie voor de nieuwe verbinding in. Vul de formule, naam, IUPAC-naam, CAS-nummer, Chemspider-ID en andere id's in.
- Gebruik de informatie die beschikbaar is in de gratis online bibliotheken (Chemspider, PubChem en Phenol Explorer) om de informatie voor de nieuwe samenstelling van interesse in te vullen. Als u klaar bent, klikt u op de knop Opslaan als nieuw om de nieuwe samengestelde informatie op te slaan in de gespecialiseerde persoonlijke database.
OPMERKING: Wanneer u informatie uit vrije bibliotheken toevoegt, moet u de samengestelde informatie opnemen zonder de aanwezigheid van chloride- of jodide-ionen. Dit kan de exacte massa en molecuulformule van de samengestelde stof van belang wijzigen.
- Herhaal het proces met alle interessante verbindingen om de gespecialiseerde persoonlijke database te voltooien.
4. Data-analyse
- Gebruik de kwalitatieve managersoftware van het instrument om de fenolische verbindingen en fenolische metabolieten in de monsters te identificeren.
- Open het voorbeeldbestand. Selecteer in het deelvenster Chromatogram definiëren de optie Chromatogrammen definiëren en extraheer het totale ionchromatogram (TIC), het geëxtraheerde ionchromatogram van MS (EIC) en de EIC van MS/MS. Selecteer de optie chromatogram integreren.
- Selecteer in het deelvenster Verbindingen zoeken de optie Zoeken op formule-opties. Selecteer in het nieuwe venster Formulebron en vervolgens de optie Database/bibliotheek . Zoek de persoonlijke database die eerder is gemaakt en klik op Openen.
- Selecteer de optie Formula Matching en stel een massamatchtolerantie in van 5 delen per miljoen (ppm).
OPMERKING: Een andere matchtolerantie van massa's kan worden ingesteld op 10 ppm; dit verschil is afhankelijk van de gebruikte massaspectrometer. - Selecteer de optie Negatieve ionen en selecteer alleen het dialoogvenster -H . Markeer in de optie Resultaten de dialoogvensters EIC extraheren, Opgeschoond spectrum extraheren, Ruw spectrum extraheren en Structuur opnemen .
- Selecteer de optie Resultaatfilters . Markeer Waarschuw als de score is en stel de score match in op 80,00%. Markeer Niet overeenkomen als de score is en stel de score in op 75,00%.
OPMERKING: De match/not match scores kunnen indien nodig worden gewijzigd in lagere waarden. Dit zal de nauwkeurigheid van de identificatie verminderen. - Klik op de find compounds by formula om interessante verbindingen in het monster te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het stapsgewijze proces voor de identificatie van fenolische metabolieten door middel van de semi-gerichte UPLC-MS/MS-analyse, in negatieve modus, van plasmamonsters is weergegeven in figuur 2. Eerst werd het totale ionchromatogram (TIC) van het plasmafenolenextract (verkregen na eiwitprecipitatie van het totale plasmamonster) verkregen via de kwalitatieve software van het instrument. Vervolgens werd het geëxtraheerde ionchromatogram gebruikt en werden de exacte massa en het fragmentatiepatroon (MS / MS-analyse) van elk signaal (of moleculair kenmerk) vergeleken met die van een specifieke persoonlijke database die ook in de software van het instrument was gemaakt. Signalen met een massamatch van minder dan 5 ppm kregen een molecuulformule uit de database toegewezen. Ten slotte werd de isotopische verdeling van elk signaal vergeleken met die van de toegewezen molecuulformule om de uiteindelijke voorlopige identificatie te bereiken. Verbindingen die a) slechts in één replicaat werden geïdentificeerd of b) een gebied lager dan 10.000 presenteerden, werden behandeld als valse identificaties. Uit deze analyse werden in totaal 25 fenolverbindingen en metabolieten geïdentificeerd in de plasmamonsters (tabel 3). In deze lijst werden zowel fenolverbindingen als hun metabolieten, zoals 3-hidroxyfenylvalerzuur en isopropyl 3-(3,4-dihydroxyfenyl)-2-hydroxypropanoaat, gevonden. Aangezien de negatieve ionisatiemodus het meest geschikt is voor alle klassen fenolverbindingen, behalve anthocyanen, konden deze verbindingen niet worden gedetecteerd met de huidige methode. Als anthocyanen belangrijke componenten van de voedselmatrix zijn, moet ook de positieve modus worden gebruikt.
| Fenolische metabolieten | R.T. (min. | Formule | Voorloper | Experimentele massa | Theoretische massa | Verschil (ppm) | |
| 2,3-Dihydroxybenzoëzuur | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-Hydroxyhippuric zuur | 8.631 | C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3,4-Dihydroxytolueen | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-Hydroxyfenylvalerzuur | 6.717 | C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-(3',4'-dihydroxyfenyl)-valeriaanzuur | 4.293 | C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-Hydroxyenterodiol | 9.201 | C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| Ajugol · | 3.889 | C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| Benzoëzuur | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| Carnosinezuur | 6.785 | C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| Carnosol | 6.347 | C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| Catechol | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| Glycitine | 6.01 | C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| Hesperetine | 6.01 | C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| Hippuurzuur | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| Homovanillinezuur | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| Isopropyl-3-(3,4-Dihydroxyfenyl)-2-hydroxypropanoaat | 6.177 | C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| Fenylazijnzuur | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| Phloretinezuur | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| Protocatechuic aldehyde | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinol | 8.837 | C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| Vanilline | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| Epicatechine 3'-O-glucuronide | 9.342 | C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| Gomisin M2 | 5.234 | C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| Irisolidon | 6.145 | C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| Urolithine C | 6.753 | C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
Tabel 3: Voorlopige identificatie van fenolverbindingen en metabolieten in plasmamonsters volgens de semi-gerichte UPLC-MS/MS-methode.
Om de effectiviteit van de ontworpen methode voor de identificatie van de belangrijkste fenolverbindingen, of hun metabolieten, die werden geabsorbeerd uit de RSF-bevattende muffin en drank te evalueren, werden vijf aleatorische monsters van de studiedeelnemers, verkregen vóór en na de 30-daagse interventie, geanalyseerd. De relatieve abundantie van elke verbinding werd berekend door het gebied onder de curve (AUC) na behandeling te delen door de AUC vóór de behandeling. Uit deze analyse kon worden vastgesteld dat sommige verbindingen alleen voorkwamen in de monsters die vóór de behandeling waren verkregen, andere bleven ongewijzigd, terwijl sommige van hen toenamen na consumptie van de functionele voedingsmiddelen. Tabel 4 toont de lijst van 12 fenolverbindingen die een toename van het plasma vertoonden na de 30-daagse consumptie van de RSF-bevattende voedingsmiddelen. Fenylazijnzuur was de enige metaboliet die consistent in hogere concentraties werd aangetroffen na de behandeling. Glycitine, een geglycosyleerd isoflavon, en 3-hydroxyfenylvalerinezuur (een fenolische metaboliet) namen toe in drie van de vijf monsters, maar daalden in de andere twee. Gomisin M2, een lignan, werd pas na de voedingsinterventie in drie van de vijf monsters gedetecteerd. De andere fenolverbindingen (zoals hesperetine, secoisolariciresinol en vanilline) en metabolieten (zoals 2-hydroxyhippuric acid) werden slechts in één monster aangetroffen en pas na de behandeling.
| Monster (AUC na behandeling/AUC vóór de behandeling) | |||||||
| Verbinding | Formule | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-Hydroxyhippuric zuur | C18H33NO4 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| 3-Hydroxyfenylvalerzuur | C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-Hydroxyenterodiol | C18H22O5 | Nd | Nd | T | Nd | Nd | |
| Glycitine | C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| Hesperetine | C16H14O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Fenylazijnzuur | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| Phloretinezuur | C9H10O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Protocatechuic aldehyde | C7H6O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Secoisolariciresinol | C20H26O6 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Vanilline | C8H8O3 | T | Nd | Nd | Nd | Nd | |
| Gomisin M2 | C22H26O6 | Nd | T | T | T | Nd | |
Tabel 4: Lijst van fenolverbindingen die toenamen in het plasma van oudere personen na 30-daagse consumptie van RSF-bevattende voedingsmiddelen. Gegevens zijn de verhoudingen van de abundantie (AUC) van elke verbinding na de behandeling in vergelijking met hun abundantie vóór de behandeling. T geeft aan dat de verbinding pas na de behandeling in het monster werd geïdentificeerd. Nd: niet gedetecteerd.
Figuur 2: Protocol voor de identificatie van fenolische samengestelde metabolieten door semi-gerichte UPLC-MS/MS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De identificatie en kwantificering van de bioactieve fytochemicaliën die worden geabsorbeerd na consumptie van een voedingsmiddel of voedingssupplement zijn cruciaal voor het aantonen en begrijpen van de gezondheidsvoordelen van deze verbindingen en de voedingsmiddelen die ze bevatten. In het huidige werk werd de UPLC-MS / MS-methode ontwikkeld, alleen gericht op de identificatie van de belangrijkste fenolverbindingen en hun metabolieten die in concentratie in plasma toenamen na een voedingsinterventie van 30 dagen met twee voedingsproducten die speciaal voor ouderen zijn geformuleerd. Aangenomen werd dat, als één verbinding pas na de interventieperiode toenam of in plasma verscheen, die verbinding was geabsorbeerd en/of biotransformeerd uit de voedingsmiddelen die in de interventie werden gebruikt.
UPLC-MS/MS is een van de voorkeurstechnologieën voor metabolomische studies waarin veel verbindingen met een laag molecuulgewicht tegelijkertijd worden geanalyseerd in complexe monsters om het effect van een behandeling of omgevingsverandering te beoordelen13. Dit kan worden gedaan door middel van gerichte en niet-gerichte (of wereldwijde) methoden. Gerichte analyses richten zich op een bekend, klein aantal metabolieten van belang. Ze zijn de beste optie voor het kwantificeren van verbindingen met beschikbare normen en bieden de beste specificiteit en gevoeligheid; deze methoden moeten echter grondig worden geoptimaliseerd voor de geselecteerde metabolieten en zijn niet in staat om onverwachte verbindingen in de monsters te detecteren12. In andere studies is HPLC in combinatie met een UV-vis-detector gebruikt om fenolzuren en metabolieten in plasma te identificeren, maar dit type onderzoek heeft analytische normen gebruikt om de verbinding van belang te identificeren en te kwantificeren15. In een andere studie werd de toevoeging van een interne standaard voorgesteld18; echter, alleen ferula en cafeïnezuren en hun metabolieten werden geanalyseerd in dit werk. Aan de andere kant is de synthese van interne normen voor fenolmetabolieten voorgesteld als alternatief voor het ontbreken van commerciële analytische normen19. Niettemin is de synthese van een grote verscheidenheid aan fenolverbindingen moeilijk, tijdrovend en duur. Niet-gerichte methoden proberen zoveel mogelijk moleculaire verbindingen te detecteren en te identificeren en zijn voornamelijk hypothese-genererend12. Ze kunnen enkele honderden verbindingen in één monster identificeren door formules toe te wijzen aan detecteerbare chromatografische signalen met karakteristieke kenmerken, zoals m / z of gemeten nauwkeurige massa, chromatografische retentietijd, isotopische vingerafdruk, enz., Dus de gegevens die door deze analyses worden gegenereerd, zijn zeer overvloedig en kunnen moeilijk te interpreteren zijn20 . Aangezien het doel van de huidige methode niet was om een volledig metabolisch profiel van de plasmamonsters te verkrijgen (wat een ongerichte benadering zou zijn), maar om de belangrijkste fenolverbindingen en fenolische metabolieten (voorheen onbekend) daarin te identificeren, werd een semi-gerichte aanpak ontworpen. Hiervoor werden alle geïdentificeerde signalen automatisch geëxtraheerd met de software van het instrument en vervolgens vergeleken met een zelf gecreëerde database die 645 fenolverbindingen en hun metabolieten bevatte, die werden verkregen uit gratis online databases. De database bevatte referentie MS/MS-fragmentatiepatronen van de verbindingen die werden gebruikt voor de toewijzing van de naam en formule van de verbinding, waardoor verbindingen in het monster nauwkeuriger kunnen worden geïdentificeerd12.
De meest kritische stappen in het protocol waren 1) monstervoorbehandeling (extractie en concentratie van fenolverbindingen en metabolieten uit plasmamonsters); 2) de opbouw van een volledige en specifieke databank voor de semi-gerichte analyse van de monsters en de identificatie van alle mogelijke verbindingen die tot een specifieke samengestelde klasse behoren; en 3) de selectie van de parameters die worden gebruikt door de kwalitatieve software van het instrument (massamatchtolerantie ppm en score%) om de verbindingen in het monster nauwkeurig te identificeren. Bij monstervoorbehandeling moet voorzichtigheid worden betracht om verlies van de interessante verbindingen te voorkomen, ze terug te winnen bij een hoge eindconcentratie en in staat te zijn storende verbindingen te elimineren. Bij het maken van de specifieke database is het van cruciaal belang om een grondig literatuuronderzoek uit te voeren en vervolgens gratis online databases te gebruiken om specifieke chemische gegevens te verkrijgen die zullen worden gebruikt voor de identificatie van verbindingen in het monster. Voor de selectie van de beste waarden voor massamatch en score was een voorafgaande validatie van de analysemethode met behulp van normen en bekende monsters vereist21,22.
Nadat het protocol was geïmplementeerd, waren de veelvoorkomende problemen en hun aanbevolen oplossingen de volgende: 1) Er werden geen verbindingen geïdentificeerd in de monsters. Dit kwam door de lage concentratie van de verbindingen en kon worden opgelost door het monster te drogen en opnieuw op te lossen in een kleiner volume. 2) Signalen verschenen in de TIC, maar verbindingen werden niet geïdentificeerd. Dit kan te wijten zijn aan een storing in massakalibratie, dus het verschil tussen experimentele en theoretische massa's was groot. In dit geval moet de massakalibratie van het instrument worden uitgevoerd volgens de fabrikant en het model van de apparatuur. Een tweede reden kan een onvolledige persoonlijke database zijn, dus het is van cruciaal belang om de database voortdurend te controleren en te onderhouden. Massa's verbindingen waarvan wordt vermoed dat ze van belang zijn, kunnen worden gecontroleerd en vergeleken met vrij beschikbare online databases of nieuwe wetenschappelijke literatuur. 3) Signalen verschenen in lege runs. Dit duidt op vervuiling en kan worden opgelost door de autosamplernaald en -kolom te reinigen. Het standaard reinigingsprotocol is om sommige runs uit te voeren met methanol, vervolgens isopropanol en ten slotte acetonitril als de mobiele fase. Vervolgens wordt de kolom opnieuw in evenwicht gebracht, waarbij de mobiele fase gedurende ten minste 30 minuten wordt uitgevoerd.
De grootste problemen bij de ontwikkeling van dit soort methoden zijn 1) de lage biologische beschikbaarheid, in algemene termen, van alle fytochemicaliën, inclusief fenolverbindingen, wat zich vertaalt in zeer lage plasmaconcentraties16; 2) de hoge diversiteit aan fenolverbindingen in voedingsmiddelen, die wordt verhoogd door hun metabolisme en biotransformatie die optreden in menselijke enterocyten en hepatocyten en de colonmicrobiota23; 3) het ontbreken van normen (sommige normen bestaan, maar zijn zeer moeilijk te verkrijgen) voor veel verbindingen, vooral voor de metabolieten, en het bestaan van enkele onbekende of niet-gekarakteriseerde verbindingen23; en 4) variabele reacties tussen individuen, zowel in absorptie als metabolisme van fytochemicaliën14. Om het probleem van lage plasmaconcentraties van fenolische metabolieten te overwinnen, moeten ze worden geëxtraheerd en geconcentreerd. Dit kan worden bereikt door micro-vaste fase extractie14 of, zoals in het huidige werk, door de toevoeging van oplosmiddelen die eiwitten neerslaan en fenolverbindingen en metabolieten oplossen, gevolgd door oplosmiddelverdamping en resuspensie in een kleiner volume19. Deze techniek is eenvoudig, economisch en geschikt voor een klein aantal monsters. De terugwinning van interessante verbindingen kan echter gemakkelijk worden verbeterd door grotere plasmavolumes te gebruiken, zodat de uiteindelijke concentratie van alle verbindingen hoger zou zijn. De hoge diversiteit aan fenolische metabolieten en het gebrek aan normen is de reden waarom een semi-gerichte aanpak werd gebruikt om de verbindingen te identificeren die door de interventie zijn verhoogd voordat wordt geprobeerd ze te kwantificeren. Door gebruik te maken van een speciaal gecreëerde database in plaats van een volledig ongerichte analyse, was het mogelijk om de talrijke primaire metabolieten in plasma te negeren en alleen te focussen op de fenolverbindingen en hun metabolieten. Een belangrijke beperking van deze database, specifiek voor fenolverbindingen en hun menselijke metabolieten, was het gebrek aan massaspectrale informatie voor veel verbindingen en hun metabolieten, wat de nauwkeurigheid van de identificatie van de verbinding vermindert.
Grote variabiliteit tussen individuen wordt regelmatig waargenomen in studies die de absorptie en het metabolisme van fenolverbindingen evalueren, zowel kwantitatief als kwalitatief. In de huidige resultaten presenteerde één persoon 18 verbindingen in het plasmamonster dat na de interventie werd genomen, terwijl de anderen er slechts 9 of 10 vertoonden. Bovendien werden veel fenolverbindingen en metabolieten alleen gevonden in de basislijnmonsters (vóór de interventie) en ze varieerden ook tussen individuen. Over het algemeen vertoonde meer dan de helft van de geïdentificeerde verbindingen hogere concentraties (AUC) vóór dan na de interventie of werden ze alleen gevonden in de pre-interventiemonsters. Daarom was het noodzakelijk om individuele monsters te vergelijken die voor en na de interventie waren genomen om te begrijpen welke verbindingen er daadwerkelijk door werden verhoogd. De enige metaboliet die na de behandeling consequent toenam, was fenylazijnzuur, een microbiële kataboliet van flavan-3-ols24 die is gevonden in het plasma van individuen in acute studies naar de consumptie van fenolrijke voedingsmiddelen14,25. De meeste studies die fenolmetabolieten in plasma hebben geïdentificeerd en gekwantificeerd, waren acute studies, waarin de samengestelde concentraties werden gecontroleerd gedurende de 24 uur na consumptie van de fenolrijke maaltijd, waarbij werd waargenomen dat hun concentraties na 24 uur in de buurt van de basale waarde lagen19,25. Daarom is het begrijpelijk dat de monsters die in het huidige werk werden geanalyseerd, lage aantallen en concentraties fenolische metabolieten vertoonden. Onlangs evalueerden Zhang et al.25 de consumptie van rode framboos, zowel in acute studies als na 4 weken suppletie. Ze merkten op dat zowel acute als chronische interventies fenolverbindingen en hun metabolieten verhoogden, terwijl na de suppletie van 4 weken de basale plasmaconcentratie van sommige metabolieten toenam (urolithinen, kaneelzuur, fenylpropionzuur en heuppouwenzuur) en van anderen afnam (geconjugeerde anthocyaninederivaten).
Een eindonderzoek van de in dit artikel ontwikkelde methode toont aan dat deze in de meeste delen zeer geschikt was voor het doel waarvoor zij was opgesteld. De monstervoorbehandeling was eenvoudig en effectief en de UPLC-scheiding en semi-gerichte MS/MS-identificatie van fenolmetabolieten werden bereikt. Deze semi-gerichte methode kan nuttig zijn als een eerste screeningsbenadering om fenolverbindingen te identificeren die kunnen worden geabsorbeerd uit verschillende voedselmatrixen, evenals de fenolische metabolieten die aanwezig zijn in menselijk plasma. Bovendien is het protocol nuttig omdat het identificatie mogelijk maakt wanneer er geen normen van fenolische verbindingen of metabolieten beschikbaar zijn. Ten slotte maakt de methode gebruik van een kleine plasmahoeveelheid, wat van cruciaal belang is in de meeste in vivo studies waar plasmamonsters schaars zijn. Het wordt echter aanbevolen om voor toekomstige studies vóór de chronische interventie een acuut onderzoek uit te voeren om de belangrijkste fenolverbindingen en metabolieten die uit de speciaal samengestelde voedingsmiddelen worden geabsorbeerd, beter te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
De auteurs zijn dankbaar voor de financiële steun van CONACYT, Mexico (CB- 2016-01-286449), en UACJ-PIVA (Projecten 313-17-16 en 335-18-13). OAMB wil CONACYT bedanken voor zijn Ph.D. beurs. Technische ondersteuning van het Multimedia Production-kantoor van UACJ wordt dankbaar erkend.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A.
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi,, Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, ÓA., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, ÓA. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
