Summary
该协议的目标是使用半靶向色谱 - 质谱法检测血浆中的酚类代谢物。
Abstract
一组23名老年人被给予功能性膳食（饮料和松饼），这些膳食是专门为预防肌肉减少症（与年龄相关的肌肉质量损失）而配制的。在干预开始时和食用功能性膳食30天后采集血浆样本。进行半靶向超高效色谱结合串联质量（UPLC-MS / MS）分析以鉴定酚类化合物及其代谢物。用乙醇沉淀血浆蛋白，浓缩样品并重悬于流动相（1：1乙腈：水）中，然后注射到UPLC-MS / MS仪器中。用C18 反相柱进行分离，并利用其实验质量，同位素分布和片段模式鉴定化合物。将感兴趣的化合物与数据库和内部半目标图书馆的化合物进行比较。初步结果表明，干预后鉴定出的主要代谢物为苯乙酸、甘氨酸、3-羟基苯戊酸和地黄素M2。
Introduction
肌肉减少症是一种进行性骨骼疾病，与老年人群肌肉加速丧失有关。这种情况会增加跌倒的风险，并导致日常生活活动有限。肌肉减少症见于约 5%-10% 的 65 岁以上人群和约 50% 的 80 岁或以上人群1。尚未批准用于治疗肌肉减少症的特定药物，因此通过身体活动和均衡饮食进行预防非常重要1，2。使用富含乳蛋白和必需氨基酸的特殊配方食品进行营养干预，在预防肌肉减少症方面显示出积极的结果2。在其他研究中，作者在饮食中加入了维生素和抗氧化剂，如维生素E和异黄酮，增加了腰部和臀部肌肉增加的益处3。
Brosimum alicastrum Sw.（Ramón）是一种生长在墨西哥热带地区的树木;由于其高营养价值，它已被玛雅文化食用4。它是蛋白质，纤维，矿物质和酚类抗氧化剂（如绿原酸5）的良好来源。由于它可以磨成粉末并用于烘焙产品或饮料中食用，最近的研究已经评估了将Ramón种子粉（RSF）掺入不同的食物中以提高其营养价值。配制了RSF补充的卡布奇诺风味饮料，该饮料富含膳食纤维，每份含有超过6克蛋白质，并被消费者高度接受;因此，它被认为是满足特殊饮食要求的潜在替代方案6。在一项后续研究中，RSF还用于配制松饼和富含蛋白质，膳食纤维，微量营养素和酚类抗氧化剂的新饮料。松饼和饮料用于老年人的饮食干预，他们每天食用两次产品，持续30天。在此期间之后，参与者的营养和肌肉减少状况有所改善，血浆的总酚含量增加7。然而，血浆中总酚类化合物的测定是通过分光光度法进行的，因此无法鉴定被吸收的实际酚类化合物;此外，这种方法对酚类化合物并不完全特异，因此可能会发生一些高估8。
鉴定和定量食用富含这些抗氧化剂的食物后被吸收的酚类化合物是一项艰巨的任务，但对于证明这些植物化学物质的生物活性是必要的。大多数酚类化合物的生物利用度较低;其中不到5%可以在血浆中没有结构转变的情况下被发现。酚类化合物经历几种生物转化，如甲基化、磺化或葡萄糖醛酸化，由肠细胞和肝细胞9进行。酚类化合物也被微生物群生物转化成细菌分解代谢物，这些分解代谢物在被吸收到血浆中后可能在体内发挥其有益作用10。例如，苯乙酸是类黄酮和低聚原花青素的细菌转化的产物，其可以抑制蔓越莓食用后尿道中高达40%的细菌（大肠杆菌）粘附11。
天然存在的酚类化合物的结构多样性，加上其代谢物的多样性和低生物利用度，使它们在血浆中的鉴定更具挑战性。使用核磁共振（NMR）和串联质谱（MS / MS）等光谱分析平台进行代谢组学分析可能是实现这一目标的最佳方法;不幸的是，该设备不容易获得，分析协议的开发仍然有限12。一些研究报告了MS / MS与分离系统（如液相色谱）相结合，作为降低代谢组学研究中质谱复杂性的策略。与传统的高效液体实验方案相比，最近引入的超高效液相色谱（UPLC）分离方法缩短了分析时间，提高了分辨率和灵敏度，因此UPLC-MS/MS系统已迅速被分析代谢组学界广泛接受13。通过这种方式，一些研究调查了酚类代谢物，并检测了蔓越莓摄入后个体血浆中来自咖啡酸、槲皮素和阿魏酸的葡萄糖醛酸衍生物，以及来自注射剂和香草酸的磺化衍生物14。以前的方案旨在发现生物流体（如血浆）中的酚类化合物和酚类代谢物。这些实验方案基于高效液相色谱（HPLC）耦合到紫外可见分光检测器15的鉴定和定量。然而，此类方案要求使用真实标准来评估绝对鉴定和准确定量。广泛的研究已经确定了UPLC-MS和UPLC-MS / MS生物流体（磺化，葡萄糖醛酸化和甲基化形式）中最常见的代谢物;然而，由于缺乏包含其完整信息的数据库，很大一部分细菌代谢物尚未被报道16。代谢物鉴定因代谢物标准品的成本和商业可用性而变得复杂。因此，最佳策略可能是无靶向或半靶向MS / MS代谢物分析，其依赖于使用分子特征信息（m / z，同位素精确质量，同位素分布和片段化模式）来确定化学特性，并将其与免费提供的在线数据库进行比较，这些数据库包含消耗多酚富集后在生物流体中鉴定的多酚代谢物12.UPLC-MS/MS研究中使用的用于鉴定酚类化合物及其代谢物的最重要数据库是人类代谢组数据库（HMDB），脂质细胞文库，METLIN文库和其他补充数据库，如PubChem，ChemSpider和Phenol Explorer17。
在本研究中，开发了一种半靶向UPLC-MS / MS方法来分析参与含RSF松饼和饮料消费研究的老年人组的血浆样本7。收集来自不同免费在线血浆代谢物数据库的数据并将其整合到一个专门的数据库中。该数据库可通过设备软件自动访问，以识别30天营养干预前后的五种血浆样品中的多酚代谢物。这样做是为了鉴定从专门配制的用于预防肌肉减少症的功能性食品中吸收的主要酚类化合物或其代谢物。
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Protocol
该协议中使用的血浆样品是在遵循所有伦理准则的先前研究中收集的，并得到了华雷斯自治大学的机构伦理和生物伦理委员会（CIEB-2018-1-37）的批准。通过UPLC-MS / MS提取和鉴定血浆中酚类化合物和代谢物的完整方案如图 1所示。
图1：通过半靶向UPLC-MS / MS方法提取和鉴定血浆中酚类化合物和代谢物的示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 样品制备
- 将血浆样品储存在-80°C直至分析。
- 在室温下解冻血浆样品15分钟。
注意：样品可以放置在37°C的水浴中以加速该过程（5分钟）。 - 将200μL血浆样品置于2mL微管中，并与1，000μL纯乙醇混合。涡旋等离子体样品30秒。
注意：处理血浆样品时，请始终使用手套。 - 将样品以6，580× g 离心5分钟。离心后，用微量移液管或巴斯德移液器收集上清液，并将其置于新的微管中。将上清液储存在4°C。
- 将上一步中的沉淀与1，000μL100%乙醇混合，涡旋30秒，然后以6，580× g 离心5分钟。
注意：沉淀是强力包装的，需要重悬良好，以确保样品与纯乙醇之间的接触。建议使用微量移液器用乙醇冲洗沉淀。 - 离心后，收集上清液并与先前从步骤1.4获得的上清液混合。在2 mL微管中。
- 使用纯氮（99.997%）在135 psi下从样品中除去乙醇。保持针头远离微管顶部1厘米，以防止样品丢失并冲洗直至样品干燥。无需加热即可蒸发乙醇。
注意：氮气流量必须很低，以防止样品损失。一旦乙醇干燥，保持氮气流量至少5分钟，以确保样品干燥。此时可以暂停协议;样品必须储存在-20°C。 避免将样品储存超过12小时。 - 将干样品重悬于100μL乙腈混合物中：水的比例为50：50（v：v）。
- 通过0.45μm尼龙注射器膜将样品直接过滤到HPLC小瓶微插入物中。
注意：样品瓶中的样品可以在分析前储存在-20°C。将样品储存不超过8小时。建议在过滤后立即将样品注入UPLC系统。
2. UPLC-MS/MS 分析
- 将3μL样品注入装有C18 反相柱（50 mm x 2.1 mm; 1.8μm）的UPLC中。将自动进样器温度设置为20°C，柱式恒温器设置为25°C。 将每个样品一式三份注入。
- 在水中使用0.1%（v：v）甲酸作为溶剂A，100%乙腈作为溶剂B.将流速设置为0.4 mL / min，梯度程序如下：0-1分钟10%B，1-4分钟30%B，4-6分钟38%B，6-8分钟60%B，8-8.5分钟60%B，8.5-9分钟10%B（表1）。
- 将质谱仪设置为负模式电离。在340°C和13 L / min的流速下使用氮气作为干燥气体。将雾化器压力设置为 60 psi。将毛细管电压设置为 4，000 V，将碎片器电压设置为 175 V，将撇油器电压设置为 65 V。在 20 V 时使用碰撞能量（表 2）。
- 扫描质量在100-1100质量电荷比（m/z）之间，对于MS/MS，扫描质量在50-1000 m/z 之间（表2）。将数据采集设置为自动 MS/MS 模式。使用以下参考质量：119.036 和 966.0007。
| 时间（分钟） | 溶剂A（高效液相色谱水中0.1%甲酸） | 溶剂B（100%乙腈） |
| 0 比 1 | 90 | 10 |
| 1 至 4 | 70 | 30 |
| 4 至 6 | 62 | 38 |
| 6 至 8 | 40 | 60 |
| 8 到 8.5 | 40 | 60 |
| 8，5 到 9 | 90 | 10 |
表1：用于通过UPLC分离酚类化合物的流动相梯度。
| 电离模式 | 阴性 |
| 干燥气体 | 氮气在340°C，流量13升/分钟 |
| 雾化器压力 | 60 磅/平方英寸 |
| 毛细管电压 | 175 V |
| MS 扫描质量 | 100-1100 米/z |
| MS/MS 扫描质量 | 50-1000 米/z |
表2：MS/MS分析的电离参数。
3. 数据库建设
- 在科学文献中搜索酚类化合物、酚类代谢物或其他感兴趣的化合物。
- 打开UPLC系统中包含的数据库管理软件。选择 文件|新的个人数据库复合库 （PCDL） |创建新的 PCDL。选择PCDL的类型： LC / MS代谢组学。设置 PCDL 的名称。然后选择“ 创建”。
- 在工具栏中，选择“ PCDL ”，然后选择 “允许编辑 ”选项。然后单击“ 查找化合物 ”按钮。
注意：由于它是新的 PCDL，因此表结果将为空。一旦新的化合物被添加到PCDL中，这种情况就会改变。- 通过从仪器的通用库中复制化合物，将化合物添加到专门的个人数据库化合物库中。打开数据库管理软件中包含的仪器现有数据库。单击“ 查找化合物”按钮。在 “单次搜索 ”选项中，输入化合物搜索条件以查找感兴趣的化合物。
注意：化合物可以通过名称，分子式，确切质量和保留时间找到。 - 在化合物结果表中，选择感兴趣的化合物。若要选择多个化合物，请单击第一个化合物，按住 Ctrl 键，然后单击每个感兴趣的化合物。然后，右键单击所有突出显示的化合物，然后选择“ 追加到 PCDL”。
- 在新窗口中，搜索并选择专用的个人数据库文件。标记“ 包括化合物的光谱（如果存在 ）”和 “包括化合物的离子淌度信息（如果存在）”框。单击 追加 按钮。在新对话框中，选择“ 是 ”以检查添加的新化合物。选择“ 否 ”以继续搜索更多感兴趣的化合物。
- 通过从仪器的通用库中复制化合物，将化合物添加到专门的个人数据库化合物库中。打开数据库管理软件中包含的仪器现有数据库。单击“ 查找化合物”按钮。在 “单次搜索 ”选项中，输入化合物搜索条件以查找感兴趣的化合物。
- 如果仪器的通用库中没有感兴趣的化合物，请手动添加新化合物。
- 打开专用个人数据库。打开后，请按照步骤 3.3 操作。选择 “编辑化合物 ”选项。单击 添加新 按钮。
- 在窗口的上半部分，填写新化合物的信息。填写公式，名称，IUPAC名称，CAS编号，化学蜘蛛ID和其他标识符。
- 使用免费在线库（Chemspider，PubChem和Phenol Explorer）中提供的信息来填写新感兴趣化合物的信息。完成后，单击“ 另存为新 ”按钮，将新的化合物信息保存在专门的个人数据库中。
注意：添加来自自由库的信息时，请确保包含不存在氯化物或碘离子的化合物信息。这可能会改变目标化合物的确切质量和分子式。
- 对所有感兴趣的化合物重复该过程，以完成专门的个人数据库。
4. 数据分析
- 使用仪器的定性管理器软件来鉴定样品中存在的酚类化合物和酚类代谢物。
- 打开示例文件。在“色谱图”面板中，选择“定义色谱 图 ”并提取总离子色谱图 （TIC）、提取的 MS 离子色谱图 （EIC） 和 MS/MS 的 EIC。选择“集成色谱图”选项。
- 在 “查找化合物”面板中 ，选择“ 按公式查找-选项”。在新窗口中，选择“ 公式源 ”，然后选择“ 数据库/库” 选项。找到以前创建的个人数据库，然后单击“ 打开”。
- 选择 “公式匹配 ”选项，并将质量匹配公差设置为百万分之 5 （ppm）。
注意：不同的质量匹配公差可以设置为10 ppm;这种差异取决于所使用的质谱仪。 - 选择“ 负离子 ”选项，然后仅选择“ -H ”对话框。在 “结果 ”选项中，标记 “提取 EIC”、“提取清理的频谱”、“提取原始频谱”以及“ 包括结构 ”对话框。
- 选择“ 结果筛选器” 选项。 如果分数为， 则标记警告，并将分数匹配设置为 80.00%。 如果分数为， 则标记为不匹配，并将分数设置为 75.00%。
注意：如果需要，匹配/不匹配的分数可以更改为较低的值。这将降低识别的准确性。 - 单击“ 按配方查找化合物” 以识别样品中感兴趣的化合物。
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Representative Results
图2描述了通过半靶向UPLC-MS / MS分析在阴性模式下鉴定酚类代谢物的分步过程。首先，通过仪器的定性软件获得来自血浆酚醛提取物的总离子色谱图（TIC）（在总血浆样品的蛋白质沉淀后获得）。然后，使用提取的离子色谱图，并将每个信号（或分子特征）的确切质量和碎片模式（MS / MS分析）与仪器软件中创建的特定个人数据库的质量和片段模式进行比较。质量匹配小于5 ppm的信号从数据库中分配一个分子式。最后，将每个信号的同位素分布与指定分子式的同位素分布进行比较，以实现最终的初步鉴定。a）仅在一个复制品中鉴定出或b）呈现面积小于10，000的化合物被视为虚假鉴定。从该分析中，在血浆样品中共鉴定出25种酚类化合物和代谢物（表3）。在该列表中，发现了酚类化合物及其代谢物，例如3-希德氧基苯戊酸和3-（3，4-二羟基苯基）-2-羟基丙酸异丙酯。由于负电离模式最适合除花青素以外的所有类别的酚类化合物，因此用本方法无法检测到这些化合物。如果花青素是食物基质的重要组成部分，也应使用阳性模式。
| 酚类代谢物 | R.T. （最小值） | 公式 | 前兆 | 实验质量 | 理论质量 | 差值（每分点） | |
| 2，3-二羟基苯甲酸 | 0.622 | C7H6O4 | 153.0203 | 154.0273 | 154.0266 | 4.2 | |
| 2-羟基荷嘌呤酸 | 8.631 | 分子式：C18H33NO4 | 410.1648 | 411.1725 | 411.1717 | 1.8 | |
| 3，4-二羟基甲苯 | 2.239 | C7H8O2 | 123.0451 | 124.0524 | 124.0524 | -0.25 | |
| 3-羟基苯基戊酸 | 6.717 | 分子式：C11H14O3 | 193.0874 | 194.0947 | 194.0943 | 2.12 | |
| 5-（3，4-二羟基苯基）戊酸 | 4.293 | 分子式：C11H14O4 | 209.0823 | 210.0894 | 210.0892 | 0.68 | |
| 6-羟基邻二醇 | 9.201 | 分子式：C18H22O5 | 317.1387 | 318.1465 | 318.1467 | -0.65 | |
| 阿朱格尔 | 3.889 | 分子式：C15H24O9 | 347.134 | 348.1418 | 348.142 | -0.59 | |
| 苯甲酸 | 3.915 | C7H6O2 | 121.0296 | 122.0367 | 122.0368 | -0.28 | |
| 肌肽酸 | 6.785 | 分子式：C20H28O4 | 331.1905 | 332.1979 | 332.1988 | -2.58 | |
| 鼠尾草酚 | 6.347 | 分子式：C20H26O4 | 329.1764 | 330.1842 | 330.1831 | 3.43 | |
| 儿茶酚 | 0.892 | C6H6O2 | 109.0297 | 110.037 | 110.0368 | 1.91 | |
| 甘氨酸 | 6.01 | 分子式：C22H22O10 | 445.1155 | 446.1228 | 446.1213 | 3.4 | |
| 橙皮素 | 6.01 | 分子式：C16H14O6 | 301.0718 | 302.0796 | 302.079 | -1.81 | |
| 马尿酸 | 1.396 | C9H9NO3 | 178.051 | 179.058 | 179.0582 | -1.16 | |
| 高香草酸 | 0.823 | C9H10O4 | 181.0503 | 182.0576 | 182.0579 | -1.88 | |
| 3-（3，4-二羟基苯基）-2-羟基丙酸异丙酯 | 6.177 | 分子式：C12H16O5 | 239.0926 | 240.0999 | 240.0998 | 0.48 | |
| 苯乙酸 | 5.666 | C8H8O2 | 135.0444 | 136.0518 | 136.0524 | -4.92 | |
| 根皮酸 | 2.811 | C9H10O3 | 165.0556 | 166.0626 | 166.063 | -2.41 | |
| 原儿茶醛 | 1.094 | C7H6O3 | 137.0247 | 138.0311 | 138.0317 | -4.5 | |
| Secoisolariciresinol | 8.837 | 分子式：C20H26O6 | 361.1656 | 362.1729 | 362.1729 | -0.23 | |
| 香草醛 | 2.508 | C8H8O3 | 151.04 | 152.0471 | 152.0473 | -1.82 | |
| 表儿茶素 3'-O-葡萄糖醛酸苷 | 9.342 | 分子式：C21H22O12 | 465.1024 | 466.109 | 466.1111 | -4.64 | |
| 戈米辛 M2 | 5.234 | 分子式：C22H26O6 | 385.1676 | 386.1746 | 386.1729 | 4.38 | |
| 鸢尾花酮 | 6.145 | 分子式：C17H14O6 | 313.0727 | 314.0798 | 314.079 | 2.33 | |
| 尿石素C | 6.753 | 分子式：C13H8O5 | 243.0294 | 244.0368 | 244.0372 | -1.69 | |
表3：通过半靶向UPLC-MS / MS方法试探性鉴定血浆样品中的酚类化合物和代谢物。
为了评估设计用于鉴定从含RSF的松饼和饮料中吸收的主要酚类化合物或其代谢物的方法的有效性，分析了在30天干预之前和之后获得的研究参与者的五个aleatory样品。通过将治疗后的曲线下面积（AUC）除以治疗前的AUC来计算每种化合物的相对丰度。从该分析中可以观察到，一些化合物仅出现在处理前获得的样品中，其他化合物保持不变，而其中一些化合物在食用功能性食品后增加。 表4 显示了12种酚类化合物的列表，这些化合物在食用含RSF的食物30天后血浆增加。苯乙酸是处理后唯一一种浓度较高的代谢物。甘氨酸、糖基化异黄酮和3-羟基苯基戊酸（酚类代谢物）在五个样品中的三个样品中增加，但在另外两个样品中减少。Gomisin M2，一种木酚素，仅在营养干预后才在五个样本中的三个中检测到。其他酚类化合物（如橙皮苷、二酚根石苋醇和香兰素）和代谢物（如2-羟基希普酸）仅在一个样品中发现，并且仅在处理后发现。
| 样品（治疗后的AUC/治疗前的AUC） | |||||||
| 复合 | 公式 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 2-羟基荷嘌呤酸 | 分子式：C18H33NO4 | T | nd | nd | nd | nd | |
| 3-羟基苯基戊酸 | 分子式：C11H14O3 | 1.30 | 2.69 | 2.69 | 0.62 | 0.62 | |
| 6-羟基邻二醇 | 分子式：C18H22O5 | nd | nd | T | nd | nd | |
| 甘氨酸 | 分子式：C22H22O10 | 1.88 | 1.07 | 1.07 | 0.43 | 0.45 | |
| 橙皮素 | 分子式：C16H14O6 | T | nd | nd | nd | nd | |
| 苯乙酸 | C8H8O2 | 4.06 | T | T | T | 1.28 | |
| 根皮酸 | C9H10O3 | T | nd | nd | nd | nd | |
| 原儿茶醛 | C7H6O3 | T | nd | nd | nd | nd | |
| Secoisolariciresinol | 分子式：C20H26O6 | T | nd | nd | nd | nd | |
| 香草醛 | C8H8O3 | T | nd | nd | nd | nd | |
| 戈米辛 M2 | 分子式：C22H26O6 | nd | T | T | T | nd | |
表4：老年人食用含无RSF食品30天后血浆中增加的酚类化合物列表。 数据是处理后每种化合物的丰度（AUC）与处理前丰度（AUC）的比率。T表示该化合物仅在处理后在样品中鉴定出来。Nd：未检测到。
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Discussion
在食用食品或食品补充剂后被吸收的生物活性植物化学物质的鉴定和定量对于证明和理解这些化合物和含有它们的食物的健康益处至关重要。在目前的工作中，开发了UPLC-MS / MS方法，仅针对鉴定主要酚类化合物及其代谢物，这些化合物在使用两种专门为老年人配制的食品进行30天的营养干预后血浆中浓度增加。据推测，如果一种化合物仅在干预期后增加或出现在血浆中，则该化合物已被吸收和/或从干预中使用的食物中生物转化。
UPLC-MS/MS 是代谢组学研究的首选技术之一，其中在复杂样品中同时分析许多低分子量化合物，以评估某些处理或环境改变的影响13。这可以通过有针对性和非靶向（或全局）方法完成。靶向分析侧重于已知的少量感兴趣代谢物。它们是用现有标准品定量化合物的最佳选择，提供最佳的特异性和敏感性;然而，这些方法必须针对所选代谢物进行彻底优化，并且无法检测样品中的意外化合物12。在其他研究中，HPLC与紫外可见分光检测器相结合已被用于鉴定血浆中的酚酸和代谢物，但这种类型的研究使用分析标准品来鉴定和定量感兴趣的化合物15。在另一项研究中，建议增加内部标准18;然而，在这项工作中仅分析了阿魏酸和咖啡酸及其代谢物。另一方面，酚类代谢物内标的合成已被提出作为缺乏商业分析标准的替代方案19。然而，合成大量酚类化合物是困难的，耗时的，昂贵的。非靶向方法试图检测和鉴定尽可能多的分子化合物，并且主要是产生假设12。他们可以通过将公式分配给具有特征特征的可检测色谱信号（例如m / z或测量的准确质量，色谱保留时间，同位素指纹等）来鉴定一个样品中的数百种化合物，因此这些分析产生的数据非常丰富，难以解释20.由于本方法的目的不是获得血浆样品的完整代谢谱（这将是一种非靶向方法），而是鉴定其中的主要酚类化合物和酚类代谢物（以前未知），因此设计了一种半靶向方法。为此，所有识别的信号都是使用仪器的软件自动提取的，然后与包含645种酚类化合物及其代谢物的自建数据库进行比较，这些化合物及其代谢物是从免费的在线数据库获得的。该数据库包括用于分配化合物名称和式的化合物的参考MS / MS片段化模式，从而可以更准确地鉴定样品中的化合物12。
方案中最关键的步骤是1）样品预处理（从血浆样品中提取和浓缩酚类化合物和代谢物）;2）构建完整和具体的数据库，用于样品的半靶向分析和鉴定属于特定化合物类别的所有可能的化合物;3）选择仪器定性软件使用的参数（质量匹配公差ppm和分数），以准确识别样品中的化合物。在样品预处理中，必须谨慎避免目标化合物的损失，以高终浓度回收它们，并能够消除干扰化合物。在创建特定数据库时，至关重要的是进行彻底的文献检索，然后使用免费的在线数据库获取将用于样品中化合物鉴定的特定化学数据。选择质量匹配和评分的最佳值需要事先使用标准品和已知样品验证分析方法21，22。
一旦实施方案，常见问题及其推荐的解决方案如下：1）样品中没有发现化合物。这是由于化合物的低浓度，可以通过干燥样品并将其重新溶解在较小的体积中来解决。2）信号出现在TIC中，但化合物未被鉴定出来。这可能是由于质量校准失败，因此实验和理论质量之间的差异很大。在这种情况下，应根据设备的制造商和型号进行仪器的质量校准。第二个原因可能是个人数据库不完整，因此不断检查和维护数据库至关重要。可以检查大量怀疑感兴趣的化合物，并将其与免费提供的在线数据库或新的科学文献进行比较。3） 信号以空白运行形式出现。这表明污染，可以通过清洁自动进样器针和样品柱来解决。标准的清洁方案是使用甲醇，然后是异丙醇，最后是乙腈作为流动相进行一些运行。然后将色谱柱重新平衡，运行流动相至少30分钟。
开发这种方法的主要困难是1）一般而言，包括酚类化合物在内的所有植物化学物质的生物利用度较低，这意味着血浆浓度非常低16;2）食物中存在的酚类化合物的高度多样性，其通过人类肠细胞和肝细胞以及结肠微生物群中发生的代谢和生物转化而增加23;3）许多化合物缺乏标准（有些标准存在但很难获得），特别是对于代谢物，以及存在一些未知或未表征的化合物23;4）个体在植物化学物质的吸收和代谢方面的可变反应14。为了克服酚类代谢物血浆浓度低的问题，应提取并浓缩它们。这可以通过微固相萃取14 来实现，或者像本工作一样，通过添加溶剂沉淀蛋白质并溶解酚类化合物和代谢物，然后以较小的体积蒸发和重悬来实现19。这种技术简单、经济，并且足以处理少量样品。然而，通过使用更大的血浆体积可以很容易地提高目标化合物的回收率，因此所有化合物的最终浓度会更高。酚类代谢物的高度多样性和缺乏标准品是使用半靶向方法在尝试量化之前鉴定干预增加的化合物的原因。通过使用专门创建的数据库而不是完全无针对性的分析，可以忽略血浆中的众多初级代谢物，仅关注酚类化合物及其代谢物。该数据库的一个重要局限性是，特定于酚类化合物及其人类代谢物，是缺乏许多化合物及其代谢物的质谱信息，这降低了化合物鉴定的准确性。
在定量和定性评估酚类化合物的吸收和代谢的研究中，经常观察到个体之间的大变异性。在目前的结果中，一个人在干预后采集的血浆样本中呈现了18种化合物，而其他人只显示了9或10种化合物。此外，许多酚类化合物和代谢物仅在基线样品中（干预前）发现，并且它们在个体之间也有所不同。总体而言，超过一半的已鉴定化合物在干预前比干预后显示出更高的浓度（AUC），或者仅在干预前的样品中发现。因此，有必要比较干预前后采集的单个样本，以了解哪些化合物实际上增加了干预。处理后唯一持续增加的代谢物是苯乙酸，这是一种黄烷-3-ols24的微生物分解代谢物，在食用富含酚类食物的急性研究中已在个体的血浆中发现14，25。大多数确定和量化血浆中酚类代谢物的研究都是急性研究，其中在食用富酚粉后24小时内监测化合物浓度，观察到24小时后，其浓度接近基础值19，25。因此，可以理解的是，本工作中分析的样品显示出低数量和浓度的酚类代谢物。最近，Zhang等人25评估了红树莓的消费情况，无论是在急性研究中还是在补充4周后。他们观察到急性和慢性干预都增加了酚类化合物及其代谢物，而在4周补充后，一些代谢物的基础血浆浓度增加（尿石素，肉桂酸，苯丙酸和马尿酸）和其他代谢物（共轭花青素衍生物）。
对本文件所开发的方法进行的最后审查表明，在大多数方面，它非常适合创建它的目的。样品预处理简单有效，实现了UPLC分离和酚类代谢物的半靶向MS/MS鉴定。这种半靶向方法可以作为第一筛选方法，用于鉴定可从不同食物基质中吸收的酚类化合物，以及人血浆中存在的酚类代谢物。此外，该协议是有用的，因为它允许在没有酚类化合物或代谢物的标准品可用时进行鉴定。最后，该方法使用少量血浆，这在大多数血浆样品稀缺的 体内 研究中至关重要。然而，建议在将来的研究中，应在长期干预之前进行急性研究，以更好地确定从特殊配方食品中吸收的主要酚类化合物和代谢物。
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Disclosures
所有作者均声明无利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢墨西哥CONACYT（CB-2016-01-286449）和UACJ-PIVA（项目313-17-16和335-18-13）的财政支持。OAMB希望感谢CONACYT的博士奖学金。非常感谢UACJ多媒体制作办公室的技术支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1x50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
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