高齢者の血漿中のフェノール代謝産物の質量分析に組み合わせた半標的超高速クロマトグラフィー
Summary
このプロトコルの目的は、半標的クロマトグラフィー質量分析法を使用して血漿中のフェノール代謝産物を検出することです。
Abstract
23人の高齢者のグループに、サルコペニア(加齢に伴う筋肉量の喪失)の予防のために特別に処方された機能的な食事(飲料とマフィン)が与えられました。血漿サンプルは、介入の開始時および機能性食事の摂取の30日後に採取された。フェノール化合物とその代謝産物を同定するために、タンデム質量(UPLC-MS/MS)分析と組み合わせた半標的超高速クロマトグラフィーを実施しました。血漿タンパク質をエタノールで沈殿させ、サンプルを濃縮し、UPLC-MS/MS装置に注入する前に移動相(1:1アセトニトリル:水)に再懸濁した。分離はC18 逆相カラムで行い、実験質量、同位体分布、およびフラグメントパターンを使用して化合物を同定しました。関心のある化合物を、データバンクおよび内部セミターゲットライブラリの化合物と比較した。予備的結果は、介入後に同定された主要な代謝産物がフェニル酢酸、グリシチン、3−ヒドロキシフェニル吉草酸、およびゴミシンM2であることを示した。
Introduction
サルコペニアは、高齢者集団における筋肉の加速的な喪失に関連する進行性の骨格障害である。この状態は転倒のリスクを高め、日常生活の限られた活動につながります。サルコペニアは、65歳以上の人の約5%〜10%、80歳以上の人の約50%に存在します1。サルコペニアの治療には特定の薬は承認されていないため、身体活動とバランスの取れた食事による予防が重要です1,2。乳製品タンパク質と必須アミノ酸が豊富に配合された特別に処方された食品による栄養介入は、サルコペニアの予防に肯定的な結果を示しています2。他の研究では、著者らはビタミンEやイソフラボンなどのビタミンや抗酸化物質を食事に含め、腰と腰の筋肉増加の利点を高めています3。
ブロシムムアリカストラム Sw.(ラモン)は、メキシコの熱帯地域で育つ木です。それはその高い栄養価のためにマヤの文化によって消費されてきました4。それはタンパク質、繊維、ミネラル、およびクロロゲン酸などのフェノール系酸化防止剤の良い供給源です5。粉末に粉砕してベーキング製品に使用したり、飲料に消費したりすることができるため、最近の研究では、栄養価を向上させるためにラモン種子粉(RSF)をさまざまな食品に組み込むことが評価されています。RSFを補ったカプチーノ風味の飲料が処方され、食物繊維が多く、1サービングあたり6g以上のタンパク質を含み、消費者に高く評価されました。したがって、それは特別な食事要件を満たすための潜在的な代替手段と考えられていました6。追跡調査では、RSFはマフィンとタンパク質、食物繊維、微量栄養素、フェノール系抗酸化物質が豊富な新しい飲料を処方するためにも使用されました。マフィンと飲料は、30日間、1日2回両方の製品を消費した高齢者のための食事介入に使用された。この期間の後、参加者の栄養状態およびサルコペニック状態は改善し、血漿の総フェノール含有量は増加した7。しかし、血漿中の全フェノール化合物の測定は分光光度法によって行われたため、吸収された実際のフェノール化合物の同定は不可能であった。さらに、この方法はフェノール化合物に完全に特有のものではないため、過大評価が起こる可能性があります8。
これらの抗酸化物質が豊富な食品の摂取後に吸収されるフェノール化合物の同定および定量化は困難な作業であるが、これらの植物化学物質の生物学的活性を実証するために必要である。ほとんどのフェノール化合物の生物学的利用能は低いです;それらの5%未満がプラズマ中の構造変換なしで見つけることができます。フェノール化合物は、メチル化、スルホン化、グルクロン酸抱合などのいくつかの生体内変換を受け、腸細胞および肝細胞によって行われる9。フェノール化合物はまた、微生物叢によって細菌の異化物に生体内変換され、血漿に吸収された後、体内で有益な効果を発揮する可能性がある10。例えば、フェニル酢酸は、フラボノイドおよびオリゴメリックプロアントシアニジンの細菌形質転換の産物であり、クランベリー摂取後の尿路における細菌(大腸菌)接着の最大40%を阻害することができる11。
天然に存在するフェノール化合物の構造的多様性は、それらの代謝産物の多様性およびそれらの低いバイオアベイラビリティーに加えて、血漿中でのそれらの同定をさらに困難にする。核磁気共鳴(NMR)やタンデム質量分析(MS/MS)などの分光分析プラットフォームを使用したメタボロミクスプロファイリングは、おそらくこの目標を達成するための最良のアプローチです。残念ながら、この機器は簡単にはアクセスできず、分析プロトコルの開発はまだ限られています12。いくつかの研究では、メタボロミクス研究における質量スペクトルの複雑さを軽減するための戦略として、分離システム(液体クロマトグラフィーなど)と組み合わせたMS / MSが報告されています。近年の超高速液体クロマトグラフィー(UPLC)分離法の導入により、従来の高速液体プロトコルと比較して分析時間が短縮され、分解能と感度が向上したため、UPLC-MS/MSシステムは分析メタボロミクスコミュニティによって急速に広く受け入れられています13。このようにして、いくつかの研究では、フェノール代謝産物を調査し、カフェ酸、ケルセチン、フェルラ酸からのグルクロン酸誘導体、ならびにクランベリー摂取後の個体の血漿中のシリンギー酸およびバニリン酸からのスルホン化誘導体を検出した14。以前のプロトコールは、血漿などの生体液中のフェノール化合物およびフェノール代謝産物を見出すことを意図していた。これらのプロトコールは、UV-vis検出器に結合された高速液体クロマトグラフィー(HPLC)による同定および定量に基づいていた15。それにもかかわらず、そのようなプロトコルは、絶対的な識別と正確な定量化を評価するために本物の標準の使用を必要とします。幅広い研究により、生体液中の最も一般的な代謝産物(スルホン化、グルクロン酸抱合型、メチル化形態)がUPLC-MSおよびUPLC-MS/MSによって同定されている。しかし、細菌代謝産物の大部分は、完全な情報を含むデータベースがないために報告されていません16。代謝産物の同定は、代謝産物標準のコストおよび商業的入手可能性によって複雑になる。したがって、最良の戦略は、分子特徴情報(m / z、モノアイソトピック正確質量、同位体分布、および断片化パターン)を使用して化学的同一性を決定し、ポリフェノールリッチトの消費後に生体液中で同定されたポリフェノール代謝産物を含む自由に利用可能なオンラインデータベースと比較する非標的または半標的MS / MS代謝産物分析であり得る12.フェノール化合物とその代謝産物の同定のためのUPLC-MS/MS研究で使用される最も重要なデータベースは、ヒトメタボロームデータベース(HMDB)、LipidBlast Library、METLINライブラリ、およびPubChem、ChemSpider、Phenol Explorerなどの他の補完的なデータベースです17。
本研究では、RSF含有マフィンおよび飲料消費試験に関与する高齢者群の血漿サンプルを分析するために、セミターゲットUPLC-MS/MS法を開発しました7。血漿代謝産物のさまざまな無料のオンラインデータベースからのデータが収集され、専門のデータベースに統合されました。このデータベースは、30日間の栄養介入の前後に5つの血漿サンプル中のポリフェノール代謝産物を同定するために、装置ソフトウェアによって自動的にアクセスすることができる。これは、サルコペニアの予防のために設計された特別に処方された機能性食品から吸収される主なフェノール化合物、またはその代謝産物を特定するために行われます。
Protocol
Representative Results
Discussion
食品または栄養補助食品の消費後に吸収される生理活性植物化学物質の同定および定量化は、これらの化合物およびそれらを含む食品の健康上の利点を実証し、理解するために極めて重要である。本研究では、高齢者向けに特別に処方された2つの食品による30日間の栄養介入後に血漿中の濃度が上昇した主要なフェノール化合物およびその代謝産物の同定のみを目的として、UPLC-MS/MS法が開発…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、メキシコのCONACYT(CB-2016-01-286449)およびUACJ-PIVA(プロジェクト313-17-16および335-18-13)からの財政的支援に感謝する。OAMBは、彼の博士号の奨学金のためにCONACYTに感謝したいと思います。UACJマルチメディア制作室からの技術サポートは、誠にありがとうございます。
Materials
| Acetonitrile | Tedia | Al1129-001 | LC Mass spectrometry |
| Autosampler | Agilent Technologies | G4226A | 1290 Infinity series |
| C18 reverse phase column | Agilent Technologies | 959757-902 | Zorbax Eclipse plus C18 2.1×50 mm, 1.8 μm; Rapid resolution HD |
| Centrifuge | Eppendorf | 5452000018 | Mini Spin; Rotor F-45-12-11 |
| Column compartment with thermostat | Agilent Technologies | G1316C | 1290 Infinity series |
| Diode Array Detector (UV-Vis) | Agilent Technologies | G4212B | 1260 Infinity series |
| Electrospray ionnization source | Agilent Technologies | G3251B | Dual sprayer ESI source |
| Formic acid | J.T. Baker | 0128-02 | Baker reagent, ACS |
| Mass Hunter Data Acquisition | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Personal Compound Datbase and Library Manager | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Mass Hunter Qualitative Analysis | Agilent Technologies | G3338AA | |
| Microcentrifuge tube | Brand | BR780546 | Microcentrifuge tube, 2 mL with lid |
| Pure ethanol | Sigma-Aldrich | E7023-1L | 200 proof, for molecular biology |
| Q-TOF LC/MS | Agilent Technologies | G6530B | 6530 Accurate Mass |
| Quaternary pump | Agilent Technologies | G4204A | 1290 Infinity series |
| Syringe filter | Thermo Scientific | 44514-NN | 17 mm, 0.45 μm, nylon membrane |
| Thermostat | Agilent Technologies | G1330B | 1290 Infinity series |
| Vial | Agilent Technologies | 8010-0199 | Amber, PFTE red silicone 2 mL with screw top and blue caps |
| Vial insert | Agilent Technologies | 5183-2089 | Vial insert 200 μL for 2mL standard opening, conical |
| Water | Tedia | WL2212-001 | LC Mass spectrometry |
References
- Morley, J. E., Anker, S. D., von Haehling, S. Prevalence, incidence, and clinical impact of sarcopenia: facts, numbers, and epidemiology-update 2014. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 5 (4), 253-259 (2014).
- Cruz-Jentoft, A. J., Sayer, A. A. Sarcopenia. The Lancet. 393 (10191), 2636-2646 (2019).
- Beaudart, C., et al. Nutrition and physical activity in the prevention and treatment of sarcopenia: systematic review. Osteoporosis International. 28 (6), 1817-1833 (2017).
- Ozer, H. K. Phenolic compositions and antioxidant activities of Maya nut (Brosimum alicastrum): Comparison with commercial nuts. International Journal of Food Properties. 20 (11), 2772-2781 (2017).
- Subiria-Cueto, R., et al. Brosimum alicastrum Sw. (Ramón): An alternative to improve the nutritional properties and functional potential of the wheat flour tortilla. Foods. 8 (12), 1-18 (2019).
- Martínez-Ruiz, N., Torres, L. E. J., del Hierro-Ochoa, J. C., Larqué-Saavedra, A. Bebida adicionada con Brosimum alicastrum sw.: Una alternativa para requerimientos dietarios especiales. Revista Salud Pública y Nutrición. 18 (3), 1-10 (2019).
- Rodríguez-Tadeo, A., et al. Functionality of bread and beverage added with brosimum alicastrum sw. Seed flour on the nutritional and health status of the elderly. Foods. 10 (8), 1-21 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Nuevo acercamiento a la interacción del reactivo de Folin-Ciocalteu con azúcares durante la cuantificación de polifenoles totales. TIP Revista Especializada en Ciencias Químico-Biológicas. 20 (2), 28-33 (2017).
- Luca, S. V., et al. Bioactivity of dietary polyphenols: The role of metabolites. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 60 (4), 626-659 (2020).
- Kawabata, K., Yoshioka, Y., Terao, J. Role of intestinal microbiota in the bioavailability and physiological functions of dietary polyphenols. Molecules. 24 (2), (2019).
- de Llano, D. G., Moreno-Arribas, M. V., Bartolomé, B. Cranberry polyphenols and prevention against urinary tract Infections: Relevant considerations. Molecules. 25 (15), (2020).
- Alsaleh, M., et al. Mass spectrometry: A guide for the clinician. Journal of Clinical and Experimental Hepatology. 9 (5), 597-606 (2019).
- Wang, X., Sun, H., Zhang, A., Wang, P., Han, Y. Ultra-performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry as a sensitive and powerful technology for metabolomic studies. Journal of Separation Science. 34 (24), 3451-3459 (2011).
- Feliciano, R. P., Mills, C. E., Istas, G., Heiss, C., Rodriguez-Mateos, A. Absorption, metabolism and excretion of cranberry (poly)phenols in humans: A dose response study and assessment of inter-individual variability. Nutrients. 9 (3), (2017).
- Mateos, R., Goya, L., Bravo, L. Uptake and metabolism of hydroxycinnamic acids (chlorogenic, caffeic, and ferulic acids) by HepG2 cells as a model of the human liver. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (23), 8724-8732 (2006).
- Rodriguez Lanzi, ., Perdicaro, C., Antoniolli, D. J., Piccoli, A., Vazquez Prieto, M. A., Fontana, A. Phenolic metabolites in plasma and tissues of rats fed with a grape pomace extract as assessed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Archives of Biochemistry and Biophysics. , 28-33 (2018).
- Hou, Y., He, D., Ye, L., Wang, G., Zheng, Q., Hao, H. An improved detection and identification strategy for untargeted metabolomics based on UPLC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 191, 113531 (2020).
- Nagy, K., et al. First identification of dimethoxycinnamic acids in human plasma after coffee intake by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1218 (3), 491-497 (2011).
- Marmet, C., Actis-Goretta, L., Renouf, M., Giuffrida, F. Quantification of phenolic acids and their methylates, glucuronides, sulfates and lactones metabolites in human plasma by LC-MS/MS after oral ingestion of soluble coffee. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 88, 617-625 (2014).
- McCord, J., Strynar, M. Identifying per-and polyfluorinated chemical species with a combined targeted and non-targeted-screening high-resolution mass spectrometry workflow. Journal of Visualized Experiments. 2019 (146), 1-15 (2019).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A., et al. Phytochemical characterization and antiplatelet activity of Mexican red wines and their by-products. South African Journal of Enology and Viticulture. 42 (1), 77-90 (2021).
- Muñoz-Bernal, &. #. 2. 1. 1. ;. A. Enriquecimiento de un vino tinto con un extracto de compuestos fenólicos provenientes de orujo de uva: bioaccesibilidad, análisis sensorial y respuesta biológica. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. , (2021).
- Low, D. Y., et al. Data sharing in PredRet for accurate prediction of retention time: Application to plant food bioactive compounds. Food Chemistry. , 357 (2021).
- Sánchez-Patán, F., et al. Gut microbial catabolism of grape seed flavan-3-ols by human faecal microbiota. Targeted analysis of precursor compounds, intermediate metabolites and end-products. Food Chemistry. 131 (1), 337-347 (2012).
- Zhang, X., Sandhu, A., Edirisinghe, I., Burton-Freeman, B. M. Plasma and urinary (poly)phenolic profiles after 4-week red raspberry (Rubus idaeus L.) intake with or without fructo-oligosaccharide supplementation. Molecules. 25 (20), (2020).
