מאמר זה מתאר זרימת עבודה של טכניקות המשמשות לבדיקת מתווכים מועמדים חדשים של גרורות מלנומה ומנגנוני הפעולה שלהם.
גרורות הן תהליך מורכב, הדורש מהתאים להתגבר על מחסומים שרק מודלים באופן חלקי על ידי בדיקות חוץ גופיות . זרימת עבודה שיטתית הוקמה תוך שימוש במודלים חזקים וניתנים לשחזור in vivo ובשיטות סטנדרטיות לזיהוי שחקנים חדשים בגרורות מלנומה. גישה זו מאפשרת הסקה של נתונים בשלבים ניסיוניים ספציפיים כדי לאפיין במדויק את תפקידו של הגן בגרורות. מודלים נקבעים על ידי החדרת תאי מלנומה מהונדסים גנטית באמצעות זריקות תוך-לבביות, תוך-עוריות או תת-עוריות לעכברים, ולאחר מכן ניטור באמצעות הדמיית in vivo סדרתית. ברגע שמגיעים לנקודות קצה שהוקמו מראש, גידולים ראשוניים ו/או איברים נושאי גרורות נקטפים ומעובדים לניתוחים שונים. ניתן למיין את תאי הגידול ולהכפיף אותם לכל אחת מכמה פלטפורמות ‘אומיקה’, כולל ריצוף RNA חד-תאי. איברים עוברים הדמיה וניתוחים אימונוהיסטופתולוגיים כדי לכמת את הנטל הכולל של גרורות ולמפות את מיקומן האנטומי הספציפי. ניתן לאמץ את הצינור הממוטב הזה, הכולל פרוטוקולים סטנדרטיים לחריטה, ניטור, קצירת רקמות, עיבוד וניתוח, עבור תרביות קצרות טווח שמקורן בחולה וקווי תאים אנושיים ומורין מבוססים של סוגי סרטן מוצקים שונים.
התמותה הגבוהה הקשורה למלנומה גרורתית בשילוב עם שכיחות גוברת של מלנומה ברחבי העולם1 (עלייה מוערכת של 7.86% עד 2025) קוראים לגישות טיפול חדשות. ההתקדמות בגילוי מטרות תלויה במודלים הניתנים לשחזור של גרורות, תהליך מורכב ביותר. לאורך השלבים של המפל הגרורתי, תאי מלנומה חייבים להתגבר על אינספור מחסומים כדי להשיג התחמקות ממערכת החיסון והתיישבות של רקמות רחוקות2. העמידות ויכולת ההסתגלות של תאי מלנומה נובעים מגורמים רבים, כולל נטל המוטציה הגנטית הגבוהה שלהם3 ומקורם העצבי, המעניקים פלסטיות פנוטיפית חיונית 3,4,5. בכל שלב, תוכניות שעתוק מאפשרות לתאי מלנומה גרורתיים לעבור ממצב אחד למשנהו בהתבסס על רמזים מההצלבה עם המיקרו-סביבה, הכוללת את מערכת החיסון6, את הסביבה החוץ-תאית 7,8 ואת הארכיטקטורה התאית של מחסומים פיזיים9 שאיתם הם באים במגע. לדוגמה, תאי מלנומה חומקים ממעקב חיסוני על ידי הפחתת הוויסות של הביטוי של גורמים חשובים המופרשים על ידי גידולים המופרשים על-ידי מערכת החיסון6.
מחקרים מתארים “נישה פרמטסטטית”, שבמסגרתה תאי מלנומה מפרישים כימוקינים וציטוקינים כדי להכין את איבר ה”מטרה” המרוחק לגרורות10. ממצאים אלה מעלים שאלות חשובות לגבי טרופיזם האיברים של תאי מלנומה גרורתיים והדרך האנטומית שהם נוקטים כדי לגשת לרקמות רחוקות. לאחר התפשטות, ידוע שתאי מלנומה שולחים גרורות באמצעות לימפה (התפשטות לימפטית) וכלי דם (התפשטות המטוגנית)2,11. בעוד שרוב החולים נמצאים עם מחלה מקומית, תת-קבוצה קטנה של מקרים מציגה מחלה גרורתית מרוחקת וללא הפצה לימפטית (מעורבות שלילית של בלוטות הלימפה)11, מה שמרמז על קיומם של מסלולים גרורתיים חלופיים למלנומה.
כאשר הם מתיישבים באתר גרורתי, תאי מלנומה עוברים התאמות אפיגנטיות ומטבוליות12,13. כדי לגשת לתאים חדשים ופלשו אליהם, תאי מלנומה משתמשים בפרוטאזות14 ובשינויי שלד11,15, המאפשרים להם לחצות ולגדול במיקומם החדש. הקושי להתמקד בתאי מלנומה שוכן במורכבות ובמספר של התאמות כאלה; לפיכך, על התחום לעשות מאמצים ליצור מחדש באופן ניסיוני כמה שיותר שלבים והתאמות. למרות ההתקדמות הרבה במבחנים במבחנה כגון אורגנואידים ותרביות תלת-ממדיות 16,17, מודלים אלה רק משחזרים באופן חלקי את המפל הגרורתי in vivo.
מודלים של מורין הראו ערך על ידי יצירת איזון בין יכולת שכפול, היתכנות טכנית וסימולציה של מחלות אנושיות. באופן תוך-שרירי, אורתטופי והטרוטופי מושתל בתאי מלנומה מקסנוגרפטים שמקורם בחולה או מתרביות קצרות טווח לעכברים הסובלים מפגיעה במערכת החיסון או מהאנישה, מייצגים את עמוד השדרה של גילוי המטרה במלנומה גרורתית. עם זאת, מערכות אלה חסרות לעתים קרובות מגבלה ביולוגית מכרעת על גרורות: מערכת החיסון. מודלים של גרורות מלנומה סינגנית בעלי אילוץ זה הם נדירים יחסית בתחום. מערכות אלה, שפותחו בעכברים מדוכאי חיסון, כולל B16-F1018, משפחת YUMM של קווי תאים19, SM120, D4M321, RIM322 או לאחרונה, RMS23 ו- M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 קווי תאי מלנומה, מאפשרות לחקור את התפקיד המורכב של התגובה החיסונית של המארח בהתקדמות מלנומה.
כאן מוצג צינור לזיהוי מטרות של גרורות מלנומה. כאשר מערכי נתונים ‘אומיים’ הולכים וגדלים נוצרים מקבוצות חולי מלנומה, אנו מניחים שמחקרים המחזיקים בהבטחה הקלינית הגדולה ביותר הם אלה הנובעים משילוב ביג דאטה, מה שמוביל לחקירה פונקציונלית ומכניסטית קפדניתשל 25,26,27,28. על ידי שימוש במודלים של עכברים כדי לחקור מטרות פוטנציאליות בתהליך הגרורתי, ניתן להסביר אירועים ספציפיים ל-in vivo ואינטראקציות רקמה, ובכך להגדיל את ההסתברות לתרגום קליני. מתוארות שיטות רבות לכימות העומס הגרורתי, המספקות נתונים משלימים על התוצאות של כל ניסוי נתון. פרוטוקול לבידוד של תאים בודדים מגידולים באיברים שונים מתואר כדי לסייע באפיון בלתי מוטה של ביטוי גנים בתאים גרורתיים, שעשוי להקדים ריצוף RNA חד-תאי או בתפזורת.
מטרת דוח טכני זה היא להציע זרימת עבודה סטנדרטית מלמעלה למטה לחקירת שחקנים פוטנציאליים בגרורות מלנומה. מכיוון שניסויי in vivo יכולים להיות יקרים וגוזלים זמן רב, אסטרטגיות למקסום היעילות ולהעלאת הערך של המידע המתקבל הן בעלות חשיבות עליונה.
חובה להשתמש בגישות משלימות לאורך…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למחלקה לטכנולוגיות מחקר מתקדמות (DART) ב- NYU Langone Health, ובמיוחד למעבדה לחקר הפתולוגיה הניסויית, למרכז הטכנולוגי של הגנום, למעבדת ציטומטריה ומיון תאים, ליבת הדמיה פרה-קלינית, הנתמכים באופן חלקי על ידי מענק התמיכה של מרכז הסרטן פרלמוטר NIH / NCI 5P30CA016087. אנו מודים לקבוצה הבין-תחומית השיתופית של מלנומה של NYU (PI: Dr. Iman Osman) על מתן גישה לתרביות קצרות טווח של מלנומה שמקורן בחולה + (10-230BM ו- 12-273BM), אשר התקבלו באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי IRB (מחקר הסכמה אוניברסלית #s16-00122 ומחקר קבוצת מלנומה שיתופית בין-תחומית #10362). אנו מודים לד”ר רוברט קרבל (אוניברסיטת טורונטו) על מתן קווי תאי מלנומה 113/6-4-4L ו-131/4-5B1* ולד”ר מיינהרד הרלין (מכון Wistar) על אספקת WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 תרביות מלנומה לטווח קצר**. E.H. נתמך על ידי NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, פרס המדע של האגודה האמריקאית לחקר מלנומה-מלנומה, ו-NIH Mellanoma SPORE (NCI P50 CA225450; פי: I.O.). איור 1 נוצר עם Biorender.com.
#15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
#3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |