JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

Надежная платформа discovery для идентификации новых медиаторов метастазирования меланомы

Published: March 08, 2022
doi:
10.3791/63186
, , , , , , , , ,
1Department of Pathology,NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group,Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology,NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core,NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology,NYU Grossman School of Medicine

Summary

В этой статье описывается рабочий процесс методов, используемых для тестирования новых потенциальных медиаторов метастазирования меланомы и их механизма (механизмов) действия.

Abstract

Метастазирование является сложным процессом, требующим от клеток преодоления барьеров, которые только неполностью моделируются анализами in vitro . Систематический рабочий процесс был создан с использованием надежных, воспроизводимых моделей in vivo и стандартизированных методов для выявления новых игроков в метастазировании меланомы. Этот подход позволяет выводить данные на конкретных экспериментальных этапах, чтобы точно охарактеризовать роль гена в метастазировании. Модели устанавливаются путем введения генетически модифицированных клеток меланомы с помощью внутрисердечных, внутрикожных или подкожных инъекций мышам с последующим мониторингом с последовательной визуализацией in vivo . Как только предварительно установленные конечные точки достигнуты, первичные опухоли и / или органы, несущие метастазы, извлекаются и обрабатываются для различных анализов. Опухолевые клетки могут быть отсортированы и подвергнуты любой из нескольких платформ «омики», включая секвенирование одноклеточной РНК. Органы проходят визуализацию и иммуногистопатологический анализ для количественной оценки общего бремени метастазов и картирования их конкретного анатомического местоположения. Этот оптимизированный конвейер, включая стандартизированные протоколы для приживления, мониторинга, сбора, обработки и анализа тканей, может быть принят для полученных от пациента краткосрочных культур и установленных линий клеток человека и мышей различных типов рака.

Introduction

Высокая смертность, связанная с метастатической меланомой, в сочетании с ростом заболеваемости меланомой во всем мире1 (по оценкам, увеличение на 7,86% к 2025 году) требует новых подходов к лечению. Достижения в обнаружении целей зависят от воспроизводимых моделей метастазирования, очень сложного процесса. На протяжении всех этапов метастатического каскада клетки меланомы должны преодолевать бесчисленные барьеры для достижения уклонения иммунной системы и колонизации отдаленных тканей2. Устойчивость и адаптивность клеток меланомы возникают из множества факторов, включая их высокую генетическую мутационную нагрузку3 и их происхождение нервного гребня, которые придают решающую фенотипическую пластичность 3,4,5. На каждом этапе транскрипционные программы позволяют метастазирующим клеткам меланомы переключаться из одного состояния в другое на основе сигналов перекрестных помех с микросредой, включающей иммунную систему6, внеклеточную среду 7,8 и клеточную архитектуру физических барьеров9, с которыми они вступают в контакт. Например, клетки меланомы избегают иммунного надзора, снижая экспрессию важных иммунопраймирующих опухолевых факторов6.

Исследования описывают «преметастатическую нишу», в которой клетки меланомы секретируют хемокины и цитокины, чтобы подготовить отдаленный «целевой» орган для метастазирования10. Эти результаты поднимают важные вопросы о тропизме органов клеток метастатической меланомы и анатомическом пути, который они проходят для доступа к отдаленным тканям. Известно, что после интравазации клетки меланомы метастазируют через лимфатические (лимфатическое распространение) и кровеносные сосуды (гематогенное распространение)2,11. В то время как у большинства пациентов присутствует локализованное заболевание, небольшое подмножество случаев представляет собой отдаленное метастатическое заболевание и отсутствие лимфатической диссеминации (отрицательное вовлечение лимфатических узлов)11, что предполагает существование альтернативных метастатических путей для меланомы.

Когда они колонизируют метастатический участок, клетки меланомы подвергаются эпигенетической и метаболической адаптации12,13. Для доступа и вторжения в новые компартменты клетки меланомы используют протеазы14 и цитоскелетные модификации 11,15, которые позволяют им перемещаться и расти в новом месте. Трудность нацеливания на клетки меланомы заключается в сложности и количестве таких адаптаций; таким образом, на местах следует приложить усилия для экспериментального воссоздания как можно большего числа шагов и адаптаций. Несмотря на многочисленные достижения в анализах in vitro, таких как органоиды и 3D-культуры16,17, эти модели лишь неполностью повторяют метастатический каскад in vivo.

Мышиные модели показали ценность, установив баланс между воспроизводимостью, технической осуществимостью и моделированием заболеваний человека. Внутрисосудистые, ортотопически и гетеротопически имплантированные клетки меланомы из полученных пациентом ксенотрансплантатов или краткосрочных культур в иммуноскомпрометированных или гуманизированных мышах представляют собой основу обнаружения мишеней при метастатической меланоме. Тем не менее, этим системам часто не хватает важнейшего биологического ограничения на метастазирование: иммунной системы. Модели метастазирования сингенной меланомы, которые обладают этим ограничением, относительно редки в этой области. Эти системы, разработанные у иммунокомпетентных мышей, включая B16-F1018, семейство клеточных линийYUMM 19, SM120, D4M321, RIM322 или совсем недавно, клеточные линии меланомы RMS23 и M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 , облегчают исследование сложной роли иммунного ответа хозяина в прогрессировании меланомы.

Здесь представлен конвейер для идентификации цели метастазирования меланомы. С увеличением и увеличением наборов данных «омики», генерируемых из когорт пациентов с меланомой, мы постулируем, что исследования, имеющие наибольшую клиническую перспективу, связаны с интеграцией больших данных, что приводит к тщательному функциональному и механистическому опросу 25,26,27,28. Используя мышиные модели для изучения потенциальных целей в метастатическом процессе, можно учитывать in vivo-специфические события и тканевые взаимодействия, тем самым увеличивая вероятность клинической трансляции. Изложены многочисленные методы количественной оценки метастатической нагрузки, предоставляющие дополнительные данные о результатах любого данного эксперимента. Описан протокол выделения одной клетки из опухолей в различных органах, чтобы помочь объективной характеристике экспрессии генов в метастатических клетках, которые могут предшествовать одноклеточному или объемному секвенированию РНК.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры для животных, включенные в следующий протокол, были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Нью-Йоркского университета (IACUC). Все процедуры проводятся в учреждениях, одобренных Ассоциацией по оценке и аккредитации Междунаро…

Representative Results

Следующие рисунки иллюстрируют, как описанный рабочий процесс был применен для идентификации новых факторов метастазирования меланомы. На рисунке 2 обобщены результаты опубликованного исследования, в котором изучались эффекты глушения фукозилтрансферазы FUT8 при мета…

Discussion

Цель этого технического отчета состоит в том, чтобы предложить стандартизированный, сверху донизу рабочий процесс для исследования потенциальных участников метастазирования меланомы. Поскольку эксперименты in vivo могут быть дорогостоящими и трудоемкими, стратегии максимизации э…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Отдел передовых исследовательских технологий (DART) в NYU Langone Health и, в частности, Исследовательскую лабораторию экспериментальной патологии, Центр геномных технологий, Лабораторию цитометрии и сортировки клеток, Доклиническое ядро визуализации, которые частично поддерживаются грантом поддержки онкологического центра Перлмуттера NIH / NCI 5P30CA016087. Мы благодарим Междисциплинарную кооперативную группу меланомы Нью-Йоркского университета (PI: Dr. Iman Osman) за предоставление доступа к краткосрочным культурам меланомы, полученным от пациента (10-230BM и 12-273BM), которые были получены с помощью протоколов, одобренных IRB (исследование универсального согласия #s16-00122 и междисциплинарное исследование Melanoma Cooperative Group #10362). Мы благодарим д-ра Роберта Кербеля (Университет Торонто) за предоставление клеточных линий меланомы 113/6-4L и 131/4-5B1* и д-ра Минхарда Херлина (Институт Вистар) за предоставление краткосрочных культур меланомы WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 меланомы**. E.H. поддерживается NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, премией Американского онкологического общества-Меланомы Research Alliance Team Science Award и NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; ПИ: И.О.). Рисунок 1 был создан с помощью Biorender.com.

Materials

#15 Scapel Blade  WPI 500242 For surgical procedures
#3 Scapel Handle WPI 500236 For surgical procedures
1 mL Tuberculin syringe, slip tip  BD 309626 Injections
10 mL syringe, slip tip  BD 301029 Perfusion
10% Formalin Sodium Buffered EK Industries 4499-20L For perfusion/tissue fixative
15 mL Conical Corning  430052 Cell culture
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352196 Cell culture
200 Proof Ethanol Deacon Labs 04-355-223 Histology
22G – 22mm needle BD 305156 Perfusion
4-0 Vicryl Suture Ethicon J464G Suture
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde  EMS 15733-10 For perfusion/tissue fixative
40µm Corning 431750 Tissue processing
5-0 Absorbable Suture  Ethicon 6542000 Closure
50 mL Conical  Corning  430828 Cell culture
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352070 Cell culture
7-0 Silk suture  FST 18020-70 Ligature
70µm Corning 431751 Tissue processing
Anti-fade mounting media   Vector Labs H-1000-10 Immunofluorescence
Approximator applying Forceps, 10cm  WPI 14189 For microsurgical procedures
Avance Bruker 3 HD NMR Console 
Biospec 7030  Bruker 7030 Micro MRI
BSA Bioreg A941 NuMA Staining
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm  WPI WP5025501 For microsurgical procedures
Coplin Staining Jar Bel-Art  F44208-1000 Histology
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG Immunofluorescence
dCas9-KRAB Addgene 110820 Genetic manipulation
DNase I NEB M0303L Tissue processing
DPBS Corning 21-030-CM Tissue processing
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade GEM 62-0167 Tissue processing
Extracellular Matrix Substrate  Corning 354234 Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative 
FBS Cytiva SH30910.03 Cell culture
Fiji Image J Fiji Image J Software Immunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer  Thermo Fisher A16104 NuMA Staining
Goat Serum Gibco PCN5000 Immunofluorescence
HBSS Corning 21-020-CV Tissue processing
Hematoxylin  Richard-Allan Scientific  7231 Histology
Illumina III  PerkinElmer CLS136334 BLI Instrument
Insulin syringe 28G – 8mm needle BD 329424 Injections
Insulin syringe 31G – 6mm needle  BD 326730 Injections
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated WPI 504478 For perfusion and surgical procedures
Isoflurane USP Covetrus 11695067772 Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip WPI WP6570 For microsurgical procedures
Ketamine HCl 100mg/mL Mylan Ind. 1049007 Anesthesia
lentiCRISPRv2 Addgene 98290 Genetic manipulation
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 Invitrogen L32472 Vascular endothelial cells marker
MEM non-essential amino acids X 100 Corning 25-025-CI Cell culture
Metzenbaum Scissors WPI 503269 For surgical procedures
Microinjection Unit KOPF 5000 Intracardiac injections
NaCl Fisher S25877  NuMA Staining
Needle 30G x 25mm BD 305128 Intracardiac Injection
Needle 33G x 15mm Hamilton 7747-01 Intracarotid Injection
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws WPI 14137-G For microsurgical procedures
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice The Jackson Laboratory 005557 Murine model
NU/J mice The Jackson Laboratory 002019 Murine model
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human  Abcam 97585 NuMA Staining
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL Gibco 15140122 Cell culture
Percoll GE 0891-01 density separation solution 
PI Classic Surgical Gloves Cardinal Health 2D72PT75X Surgery
pLKO Tet-On Addgene 21915 Genetic manipulation
Povidone-Iodine 10% Solution Medline MDS093943 Surgery
Proparacaine Drops 0.5% Akorn Pharma AX0501 Opthalmic local anesthetic
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment Dechra 83592 Anesthesia
Razor Blade Double Edge Blades  EMS 72000 Shaving and Vibrotome Brain Slicing 
Reflex 9mm EZ Clip  Braintree EZC- KIT Wound closure
RPMI 1640  Corning 10-040-CM Cell culture
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades WPI 501235 For microsurgical procedures
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome Leica VT1200 Brain Slice Immunofluorescence
Single Channel Anesthesia Vaporizer System Kent Scientific VetFlo-1210S  Anesthesia
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower EZ Systems TT4000 CO2 Euthanasia
Sterile Fenestrated Disposable Drape Medline NON21002 Surgery
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves Medline DYNJP2715 Surgery
T25 Flask Corning  430639 Cell culture
Tris Corning 46-031-CM NuMA Staining
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML Immunofluorescence
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform WPI WP505210 For microsurgical procedures
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg WPI 15911 For microsurgical procedures
Visiopharm Visiopharm Visiopharm NuMA Staining Quantification Software
Xylasine 100mg/mL Akorn Pharma 59399-111-50 Anesthesia
Xylene Fisher X3P-1GAL Histology
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
  3. Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
  4. Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).
  5. Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
  6. Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319 (2017).
  7. Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
  8. Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
  9. Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine – Dermatology. 5, 307 (2018).
  10. Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
  11. Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
  12. Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
  13. Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  15. Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
  16. Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
  17. Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  18. Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
  19. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  20. Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).
  21. Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
  22. Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
  23. Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).
  24. Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
  25. Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  26. Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
  27. Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
  28. Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
  29. de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
  30. Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
  31. Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
  32. Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
  33. Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885 (2019).
  34. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  35. Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376 (2018).
  36. Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
  37. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  38. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  39. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
  40. Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
  41. Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
  42. Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).

Tags

Melanoma MetastasisIn Vivo ModelsTarget DiscoveryTherapy DevelopmentIntradermal InjectionIntracardiac InjectionTumor Growth MonitoringUltrasound Guidance

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shadaloey, A. A. S., Karz, A., Moubarak, R. S., Agrawal, P., Levinson, G., Kleffman, K., Aristizabal, O., Osman, I., Wadghiri, Y. Z., Hernando, E. A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis. J. Vis. Exp. (181), e63186, doi:10.3791/63186 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image