Denne artikkelen beskriver en arbeidsflyt av teknikker som brukes til å teste nye kandidatmeglere av melanommetastase og deres virkningsmekanisme(er).
Metastase er en kompleks prosess som krever at celler overvinner barrierer som bare er ufullstendig modellert av in vitro-analyser . En systematisk arbeidsflyt ble etablert ved hjelp av robuste, reproduserbare in vivo-modeller og standardiserte metoder for å identifisere nye aktører i melanommetastase. Denne tilnærmingen gjør det mulig for data inferens på spesifikke eksperimentelle stadier å nøyaktig karakterisere et gens rolle i metastase. Modeller etableres ved å introdusere genetisk modifiserte melanomceller via intrakariac, intradermale eller subkutane injeksjoner i mus, etterfulgt av overvåking med seriell in vivo-avbildning . Når preetablerte endepunkter er nådd, høstes primærtumorer og/eller metastaserbærende organer og bearbeides for ulike analyser. Tumorceller kan sorteres og utsettes for en av flere ‘omics’ plattformer, inkludert encellet RNA-sekvensering. Organer gjennomgår avbildnings- og immunohistopatologiske analyser for å kvantifisere den totale byrden av metastaser og kartlegge deres spesifikke anatomiske plassering. Denne optimaliserte rørledningen, inkludert standardiserte protokoller for engraftment, overvåking, vevshøsting, behandling og analyse, kan vedtas for pasientavledede, kortsiktige kulturer og etablerte menneskelige og murincellelinjer av ulike faste krefttyper.
Den høye dødeligheten forbundet med metastatisk melanom kombinert med en økende forekomst av melanom over hele verden1 (anslagsvis 7,86% økning innen 2025) krever nye behandlingsmetoder. Fremskritt innen måloppdagelse avhenger av reproduserbare modeller av metastase, en svært kompleks prosess. Gjennom trinnene i den metastatiske kaskaden må melanomceller overvinne utallige barrierer for å oppnå immunsystemunndragelse og kolonisering av fjernt vev2. Motstandskraften og tilpasningsevnen til melanomceller oppstår fra en rekke faktorer, inkludert deres høye genetiske mutasjonsbyrde3 og deres nevrale crest-opprinnelse, som gir avgjørende fenotypisk plastisitet 3,4,5. På hvert trinn tillater transkripsjonsprogrammer metastaserende melanomceller å bytte fra en stat til en annen basert på signaler fra krysstalet med mikromiljøet, som består av immunsystemet6, det ekstracellulære miljøet 7,8 og den cellulære arkitekturen til fysiske barrierer9 som de kommer i kontakt med. For eksempel unnslipper melanomceller immunovervåking ved å nedregulere uttrykket av viktige immunprimende tumorutskilte faktorer6.
Studier beskriver en “premetastatisk nisje”, hvor melanomceller skiller ut kjemokiner og cytokiner for å prime det fjerne “mål” organet for metastase10. Disse funnene reiser viktige spørsmål om organtropismen til metastatiske melanomceller og den anatomiske ruten de tar for å få tilgang til fjernt vev. Etter intravasasjon er melanomceller kjent for å metastasere gjennom lymfatikk (lymfatisk spredning) og blodkar (hematogen spredning)2,11. Mens de fleste pasienter presenterer med lokalisert sykdom, presenterer en liten undergruppe av tilfeller med fjern metastatisk sykdom og ingen lymfatisk formidling (negativ lymfeknuteinvolvering)11, noe som tyder på eksistensen av alternative metastatiske veier for melanom.
Når de koloniserer et metastatisk sted, gjennomgår melanomceller epigenetiske og metabolske tilpasninger12,13. For å få tilgang til og invadere nye rom bruker melanomceller proteaser14 og cytoskeletale modifikasjoner 11,15, noe som gjør dem i stand til å traversere til og vokse på sitt nye sted. Vanskeligheten med å målrette melanomceller ligger i kompleksiteten og antallet slike tilpasninger; Feltet bør derfor gjøre en innsats for å gjenskape så mange trinn og tilpasninger som mulig. Til tross for mange fremskritt i in vitro-analyser som organoider og 3D-kulturer16,17, recapitulaterer disse modellene bare ufullstendig in vivo metastatisk kaskade.
Murine modeller har vist verdi ved å slå en balanse mellom reproduserbarhet, teknisk gjennomførbarhet og simulering av menneskelig sykdom. Intravaskulært, ortopisk og heterotopisk implanterte melanomceller fra pasientavledede xenografter eller kortsiktige kulturer til immunkompliserte eller humaniserte mus representerer ryggraden i måloppdagelse i metastatisk melanom. Imidlertid mangler disse systemene ofte en avgjørende biologisk begrensning på metastase: immunsystemet. Syngeneiske melanommetastasemodeller som har denne begrensningen er relativt knappe i feltet. Disse systemene, utviklet i immunompende mus, inkludert B16-F1018, YUMM-familien av cellelinjer19, SM120, D4M321, RIM322 eller mer nylig, RMS23 og M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 melanomcellelinjer, lette undersøkelsen av den komplekse rollen til vertsresponsen immun i melanomprogresjon.
Her presenteres en rørledning for melanommetastasemålidentifikasjon. Med økende og større ‘omics’ datasett som genereres fra melanom pasientkohorter, postulerer vi at studier som holder det mest kliniske løftet er de som stammer fra big data-integrasjon, noe som fører til omhyggelig funksjonell og mekanistisk avhør 25,26,27,28. Ved å bruke musemodeller til å studere potensielle mål i den metastatiske prosessen, kan man redegjøre for in vivo-spesifikke hendelser og vevsinteraksjoner, og dermed øke sannsynligheten for klinisk oversettelse. Flere metoder for å kvantifisere metastatisk byrde skisseres, og gir komplementære data om resultatene av et gitt eksperiment. En protokoll for encellet isolasjon fra svulster i ulike organer er beskrevet for å hjelpe den objektive karakteriseringen av genuttrykk i metastatiske celler, som kan komme før encellet eller bulk RNA-sekvensering.
Målet med denne tekniske rapporten er å tilby en standardisert, topp-til-bunn arbeidsflyt for undersøkelse av potensielle aktører i melanommetastase. Ettersom in vivo-eksperimenter kan være kostbare og tidkrevende, er strategier for å maksimere effektiviteten og øke verdien av den oppnådde informasjonen avgjørende.
Det er viktig å bruke komplementære tilnærminger gjennomgående for å kryssvalidere funn i samme eksperiment. For eksempel er både NuMA immunhiistokjemisk far…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Divisjonen for avanserte forskningsteknologier (DART) ved NYU Langone Health, og spesielt Experimental Pathology Research Laboratory, Genome Technology Center, Cytometry and Cell Sorting Laboratory, Pre-Clinical Imaging Core, som delvis støttes av Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087. Vi takker NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) for å gi tilgang til pasientavledede melanom kortsiktige kulturer+ (10-230BM og 12-273BM), som ble oppnådd gjennom IRB-godkjente protokoller (Universal Consent study #s16-00122 og Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group studie #10362). Vi takker Dr. Robert Kerbel (University of Toronto) for å ha levert 113/6-4L og 131/4-5B1 melanomcellelinjer* og Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) for å gi WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 melanom kortsiktige kulturer**. E.H. støttes av NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award og en NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). Figur 1 ble opprettet med Biorender.com.
#15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
#3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |