Denna artikel beskriver ett arbetsflöde av tekniker som används för att testa nya kandidatmedlare av melanommetastaser och deras verkningsmekanismer.
Metastasering är en komplex process som kräver att celler övervinner barriärer som endast är ofullständigt modellerade av in vitro-analyser . Ett systematiskt arbetsflöde etablerades med hjälp av robusta, reproducerbara in vivo-modeller och standardiserade metoder för att identifiera nya aktörer inom melanommetastasering. Detta tillvägagångssätt möjliggör datainferens vid specifika experimentella stadier för att exakt karakterisera en gens roll i metastasering. Modeller etableras genom att införa genetiskt modifierade melanomceller via intrakardiella, intradermala eller subkutana injektioner i möss, följt av övervakning med seriell in vivo-avbildning . När företablerade effektmått har uppnåtts skördas och bearbetas primära tumörer och/eller metastasbärande organ för olika analyser. Tumörceller kan sorteras och utsättas för någon av flera “omics” -plattformar, inklusive encellig RNA-sekvensering. Organ genomgår avbildning och immunohistopatologiska analyser för att kvantifiera den totala bördan av metastaser och kartlägga deras specifika anatomiska läge. Denna optimerade pipeline, inklusive standardiserade protokoll för engraftment, övervakning, vävnadsskörd, bearbetning och analys, kan antas för patienthärledda, kortsiktiga kulturer och etablerade humana och murina cellinjer av olika fasta cancertyper.
Den höga dödligheten i samband med metastaserande melanom i kombination med en ökande förekomst av melanom över hela världen1 (uppskattningsvis 7,86% ökning fram till 2025) kräver nya behandlingsmetoder. Framsteg inom målupptäckt hänger på reproducerbara modeller av metastasering, en mycket komplex process. Under stegen i den metastatiska kaskaden måste melanomceller övervinna otaliga hinder för att uppnå immunsystemets undvikande och kolonisering av avlägsna vävnader2. Melanomcellernas motståndskraft och anpassningsförmåga härrör från en mängd faktorer, inklusive deras höga genetiska mutationsbörda3 och deras neurala crest ursprung, vilket ger avgörande fenotypisk plasticitet 3,4,5. Vid varje steg tillåter transkriptionsprogram metastaserande melanomceller att växla från ett tillstånd till ett annat baserat på signaler från överhörningen med mikromiljön, bestående av immunsystemet6, den extracellulära miljön 7,8 och den cellulära arkitekturen för fysiska barriärer9 som de kommer i kontakt med. Till exempel undgår melanomceller immunövervakning genom att nedreglera uttrycket av viktiga immunprimande tumörutsöndrade faktorer6.
Studier beskriver en “premetastatisk nisch”, där melanomceller utsöndrar kemokiner och cytokiner för att prima det avlägsna “mål” -organet för metastasering10. Dessa fynd väcker viktiga frågor om organtropismen hos metastaserande melanomceller och den anatomiska vägen de tar för att komma åt avlägsna vävnader. Efter intravasering är melanomceller kända för att metastasera genom lymfatik (lymfatisk spridning) och blodkärl (hematogen spridning)2,11. Medan de flesta patienter som uppvisar lokaliserad sjukdom, uppvisar en liten delmängd av fallen avlägsen metastatisk sjukdom och ingen lymfatisk spridning (negativ lymfkörtelinvolvering)11, vilket tyder på förekomsten av alternativa metastatiska vägar för melanom.
När de koloniserar ett metastatiskt stället genomgår melanomceller epigenetiska och metaboliska anpassningar12,13. För att komma åt och invadera nya fack använder melanomceller proteaser14 och cytoskelettmodifieringar 11,15, vilket gör det möjligt för dem att korsa till och växa på sin nya plats. Svårigheten att rikta in sig på melanomceller ligger i komplexiteten och antalet sådana anpassningar; Fältet bör därför anstränga sig för att experimentellt återskapa så många steg och anpassningar som möjligt. Trots många framsteg inom in vitro-analyser som organoider och 3D-kulturer 16,17, sammanfattar dessa modeller endast ofullständigt den in vivo metastatiska kaskaden.
Murinmodeller har visat värde genom att hitta en balans mellan reproducerbarhet, teknisk genomförbarhet och simulering av mänsklig sjukdom. Intravaskulärt, ortotopiskt och heterotopiskt implanterade melanomceller från patienthärledda xenotransplantat eller kortvariga kulturer till immunförsvagade eller humaniserade möss utgör ryggraden i målupptäckten vid metastaserat melanom. Dessa system saknar emellertid ofta en avgörande biologisk begränsning av metastasering: immunsystemet. Syngena melanommetastasmodeller som har denna begränsning är relativt knappa inom området. Dessa system, utvecklade i immunkompetenta möss, inklusive B16-F1018, YUMM-familjen av cellinjer19, SM120, D4M321, RIM322 eller mer nyligen, RMS23 och M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905) 24 melanomcellinjer, underlättar undersökningen av värdimmunsvarets komplexa roll i melanomprogression.
Här presenteras en pipeline för målidentifiering av melanommetastaser. Med ökande och större “omics” -dataset som genereras från melanompatientkohorter postulerar vi att studier som håller det mest kliniska löftet är de som härrör från stor dataintegration, vilket leder till noggrann funktionell och mekanistisk förhör 25,26,27,28. Genom att använda musmodeller för att studera potentiella mål i den metastatiska processen kan man redogöra för in vivo-specifika händelser och vävnadsinteraktioner, vilket ökar sannolikheten för klinisk översättning. Flera metoder för att kvantifiera metastatisk börda beskrivs, vilket ger kompletterande data om resultaten av ett givet experiment. Ett protokoll för encellsisolering från tumörer i olika organ beskrivs för att underlätta opartisk karakterisering av genuttryck i metastatiska celler, vilket kan föregå encells- eller bulk-RNA-sekvensering.
Syftet med denna tekniska rapport är att erbjuda ett standardiserat, top-to-bottom arbetsflöde för undersökning av potentiella aktörer inom melanommetastasering. Eftersom in vivo-experiment kan vara kostsamma och tidskrävande är strategier för att maximera effektiviteten och öka värdet av den erhållna informationen av största vikt.
Det är absolut nödvändigt att använda kompletterande metoder hela tiden för att korsvalidera fynd inom samma experiment. Till exempel är …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar avdelningen för avancerad forskningsteknik (DART) vid NYU Langone Health, och i synnerhet Experimental Pathology Research Laboratory, Genome Technology Center, Cytometry and Cell Sorting Laboratory, Pre-Clinical Imaging Core, som delvis stöds av Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087. Vi tackar NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) för att ge tillgång till patient-härledda melanom kortvariga kulturer + (10-230BM och 12-273BM), som erhölls genom IRB-godkända protokoll (Universal Consent-studie #s16-00122 och Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group study #10362). Vi tackar Dr. Robert Kerbel (University of Toronto) för att ha tillhandahållit 113/6-4L och 131/4-5B1 melanomcellinjer* och Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) för att tillhandahålla WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 melanom kortsiktiga kulturer**. E.H. stöds av NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, ett American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award och ett NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). Figur 1 skapades med Biorender.com.
#15 Scapel Blade | WPI | 500242 | For surgical procedures |
#3 Scapel Handle | WPI | 500236 | For surgical procedures |
1 mL Tuberculin syringe, slip tip | BD | 309626 | Injections |
10 mL syringe, slip tip | BD | 301029 | Perfusion |
10% Formalin Sodium Buffered | EK Industries | 4499-20L | For perfusion/tissue fixative |
15 mL Conical | Corning | 430052 | Cell culture |
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352196 | Cell culture |
200 Proof Ethanol | Deacon Labs | 04-355-223 | Histology |
22G – 22mm needle | BD | 305156 | Perfusion |
4-0 Vicryl Suture | Ethicon | J464G | Suture |
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde | EMS | 15733-10 | For perfusion/tissue fixative |
40µm | Corning | 431750 | Tissue processing |
5-0 Absorbable Suture | Ethicon | 6542000 | Closure |
50 mL Conical | Corning | 430828 | Cell culture |
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | Cell culture |
7-0 Silk suture | FST | 18020-70 | Ligature |
70µm | Corning | 431751 | Tissue processing |
Anti-fade mounting media | Vector Labs | H-1000-10 | Immunofluorescence |
Approximator applying Forceps, 10cm | WPI | 14189 | For microsurgical procedures |
Avance | Bruker | 3 HD | NMR Console |
Biospec 7030 | Bruker | 7030 | Micro MRI |
BSA | Bioreg | A941 | NuMA Staining |
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm | WPI | WP5025501 | For microsurgical procedures |
Coplin Staining Jar | Bel-Art | F44208-1000 | Histology |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Immunofluorescence |
dCas9-KRAB | Addgene | 110820 | Genetic manipulation |
DNase I | NEB | M0303L | Tissue processing |
DPBS | Corning | 21-030-CM | Tissue processing |
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade | GEM | 62-0167 | Tissue processing |
Extracellular Matrix Substrate | Corning | 354234 | Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative |
FBS | Cytiva | SH30910.03 | Cell culture |
Fiji Image J | Fiji Image J | Software | Immunofluorescence |
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer | Thermo Fisher | A16104 | NuMA Staining |
Goat Serum | Gibco | PCN5000 | Immunofluorescence |
HBSS | Corning | 21-020-CV | Tissue processing |
Hematoxylin | Richard-Allan Scientific | 7231 | Histology |
Illumina III | PerkinElmer | CLS136334 | BLI Instrument |
Insulin syringe 28G – 8mm needle | BD | 329424 | Injections |
Insulin syringe 31G – 6mm needle | BD | 326730 | Injections |
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated | WPI | 504478 | For perfusion and surgical procedures |
Isoflurane USP | Covetrus | 11695067772 | Anesthesia |
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip | WPI | WP6570 | For microsurgical procedures |
Ketamine HCl 100mg/mL | Mylan Ind. | 1049007 | Anesthesia |
lentiCRISPRv2 | Addgene | 98290 | Genetic manipulation |
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 | Invitrogen | L32472 | Vascular endothelial cells marker |
MEM non-essential amino acids X 100 | Corning | 25-025-CI | Cell culture |
Metzenbaum Scissors | WPI | 503269 | For surgical procedures |
Microinjection Unit | KOPF | 5000 | Intracardiac injections |
NaCl | Fisher | S25877 | NuMA Staining |
Needle 30G x 25mm | BD | 305128 | Intracardiac Injection |
Needle 33G x 15mm | Hamilton | 7747-01 | Intracarotid Injection |
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws | WPI | 14137-G | For microsurgical procedures |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Murine model |
NU/J mice | The Jackson Laboratory | 002019 | Murine model |
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human | Abcam | 97585 | NuMA Staining |
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL | Gibco | 15140122 | Cell culture |
Percoll | GE | 0891-01 | density separation solution |
PI Classic Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PT75X | Surgery |
pLKO Tet-On | Addgene | 21915 | Genetic manipulation |
Povidone-Iodine 10% Solution | Medline | MDS093943 | Surgery |
Proparacaine Drops 0.5% | Akorn Pharma | AX0501 | Opthalmic local anesthetic |
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment | Dechra | 83592 | Anesthesia |
Razor Blade Double Edge Blades | EMS | 72000 | Shaving and Vibrotome Brain Slicing |
Reflex 9mm EZ Clip | Braintree | EZC- KIT | Wound closure |
RPMI 1640 | Corning | 10-040-CM | Cell culture |
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades | WPI | 501235 | For microsurgical procedures |
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome | Leica | VT1200 | Brain Slice Immunofluorescence |
Single Channel Anesthesia Vaporizer System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Anesthesia |
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower | EZ Systems | TT4000 | CO2 Euthanasia |
Sterile Fenestrated Disposable Drape | Medline | NON21002 | Surgery |
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves | Medline | DYNJP2715 | Surgery |
T25 Flask | Corning | 430639 | Cell culture |
Tris | Corning | 46-031-CM | NuMA Staining |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | Immunofluorescence |
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform | WPI | WP505210 | For microsurgical procedures |
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg | WPI | 15911 | For microsurgical procedures |
Visiopharm | Visiopharm | Visiopharm | NuMA Staining Quantification Software |
Xylasine 100mg/mL | Akorn Pharma | 59399-111-50 | Anesthesia |
Xylene | Fisher | X3P-1GAL | Histology |