הפעלה מחדש של תאי גזע עצביים במוח דרוזופילה מתורבת
Summary
שיטה להפעיל מחדש תאי גזע עצביים שקטים בגרשי מוח דרוזופילה מתורבתים הוקמה. בשיטה זו, ניתן לנתק את תפקיד האותות המערכתיים מאותות מהותיים רקמה בוויסות של השבתת תאי גזע עצביים, כניסה ויציאה.
Abstract
לתאי גזע עצביים (NSCs) יש את היכולת להתרבות, להבדיל, לעבור אפופטוזיס, ואפילו להיכנס ולצאת מההירגעות. רבים מתהליכים אלה נשלטים על ידי יחסי הגומלין המורכבים בין תוכניות גנטיות מהותיות של המל”ל עם גורמים חיצוניים של המל”ל, מקומיים ומערכתיים. באורגניזם המודל הגנטי, Drosophila melanogaster, NSCs, המכונה נוירובלסטים (NBs), לעבור מ quiescence להתפשטות במהלך המעבר העוברי לזחל. במהלך תקופה זו, זחלים מגיחים מקליפות הביצים שלהם ומתחילים לזחול, בחיפוש אחר חומרים מזינים תזונתיים. בתגובה להאכלת בעלי חיים, גוף השומן, איבר אנדוקריני עם יכולת אחסון שומנים בדם, מייצר אות, אשר משתחרר באופן שיטתי לתוך המולימפה במחזור. בתגובה לאות שמקורו בגוף השומן (FBDS), פפטידים דמויי אינסולין Drosophila (Dilps) מיוצרים ומשוחררים מתאי עצב neurosecretory במוח וגליה, מה שמוביל להפעלה במורד הזרם של פי3-קינאז צמיחה איתות NBs ואת נישה גליה וקשת קנה הנשימה שלהם. למרות שזהו המודל הנוכחי לאופן שבו NBs עוברים מדיכאון להתפשטות, אופיו של האות החיצוני FBDS נשאר חמקמק. כדי להבין טוב יותר כיצד רמזים מערכתיים חיצוניים של NB מווסתים את היציאה מדיכאון, פותחה שיטה לתרבות המוחות הזחליים המוקדמים במבחנה לפני האכלת בעלי חיים. בשיטה זו, ניתן לספק גורמים אקסוגניים למדיה התרבותית וליציאה של NB מהקיפאון. מצאנו כי אינסולין אקסוגני מספיק כדי להפעיל מחדש NBs מ quiescence ב explants כל המוח. מכיוון ששיטה זו מתאימה היטב למסכים בקנה מידה גדול, אנו שואפים לזהות רמזים חיצוניים נוספים המסדירים את השבתת NB לעומת החלטות התפשטות. מכיוון שהגנים והמסלולים המסדירים את החלטות התפשטות המל”ל נשמרים אבולוציונית, התוצאות של בדיקה זו יכולות לספק תובנה לשיפור הטיפולים הרגנרטיביים במרפאה.
Introduction
תאי גזע הם עניין רב בגלל הפוטנציאל שלהם לשימוש ברפואה רגנרטיבית 1,2. בעלי חיים רבים, במיוחד אלה שחיו זמן רב, שומרים על תאי גזע בתוך הרקמות הבוגרות שלהם. תאי גזע מקומיים אלה פועלים כדי לשמור על הומאוסטזיס רקמות ומנוצלים לתיקון בעקבות פגיעה גופנית או מחלה 3,4. רוב תאי הגזע בבעלי חיים בוגרים הם רגיעה, מצב רדום יחסית המאופיין על ידי מעצר מחזור התאים ואיון של צמיחה איתות5. בתגובה לרמזים חיצוניים, תאי גזע יוצאים מדיכאון, נכנסים למחזור התא ומתחילים לייצר צאצאי בת ספציפיים לסוג הרקמה שלהם. לדוגמה, על מנת להרכיב תגובה חיסונית יעילה, תאים המציגים אנטיגן גורמים לתאי T נאיביים רגיעה להיכנס למחזור התאים ולהתרחב באופן קלוני6. בתגובה לנזק לשרירי השלד, תאי גזע לווין שריר להיכנס מחזור התא וליצור myoblasts הבת להחליף myofibrils פגום 5,7. אמנם ברור כי תאי גזע שקטים מגיבים לאותות חיצוניים, במקרים רבים, אופיו של הסימן החיצוני נותר לא ברור, כמו גם את המנגנון של הפעלת תאי גזע הנגרמים על ידי אותות. השגת הבנה טובה יותר של האופן שבו תאי גזע שקטים מגיבים לרמזים חיצוניים ונכנסים למחזור התאים תסייע בפיתוח טיפולים טובים יותר בתאי גזע במרפאה ותגביר את הידע המדעי.
במשך עשרות שנים, אורגניזמים מודל שימשו כדי לחשוף את הגנים ואת מסלולי איתות התאים המסדירים את התפשטות תאי הגזע במהלך ההתפתחות ובבגרות. ב Drosophila, תאי גזע עצביים (NSCs), המכונה neuroblasts (NBs), לחלק לאורך כל הפיתוח כדי ליצור את כל הנוירונים גליה כי בסופו של דבר לשלב, ויוצרים את המעגל העצבי הנדרש לתפקוד המוח 8,9. כמו תאי גזע אחרים, NBs מתחלקים באופן אסימטרי לחידוש עצמי, ובמקרים מסוימים, באופן סימטרי כדי להרחיב את מאגר תאי הגזע. NBs מצוינים במהלך העובר ורובם נכנסים לרגיעה לקראת הסוף, במקביל לירידה בחנויות התזונתיים האימהיות (איור 1). לאחר השלמת העובר, הזחלים בוקעים ומתחילים לאכול. בתגובה להאכלת בעלי חיים, NBs להפעיל מחדש מן השבתה ולחדש חלוקת תאים 10,11,12,13,14,15,16. מכיוון שמערכת העצבים המרכזית של Drosophila היא פשוטה יחסית ומכיוון ש- NBs נכנסים ויוצאים מהשבתה בזמנים מוגדרים, השימוש בדרוסופילה כדי לחקור את הרגולציה של רגיעה, כניסה ויציאה, מוכיח אידיאלי.
איור 1: התפשטות יחסית של CB NBs (נוירובלסטים במוח מרכזי, אדום) ו- MB NBs (נוירובלסטים של גוף פטריות, כחול) לאורך זמן התפתחותי. בסוף העובר, רוב NBs (קו אדום) להפסיק התפשטות ולהיכנס רגיעה. השקט נמשך עד שזחלים טריים בקעו צורכים את הארוחה המלאה הראשונה שלהם. נקודות הזמן של המיקוד עבור מתודולוגיה זו מסומנות בעיגולים אדומים (1, quiescence ו 2, הפעלה מחדש). MB NBs (כחול) הם תת-קבוצה של NBs במוח המרכזי המתחלקים ללא הרף לאורך כל ההתפתחות (4 לכל חצי הכדור במוח). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
בתגובה להאכלת בעלי חיים, מסלולי איתות צמיחה PI3-kinase ו- TOR הופכים פעילים ב- NBs ובנישה גליה וקנה הנשימה שלהם 10,11,15,16. כאשר חומרים מזינים תזונתיים נסוגים או כאשר רמות של PI3-קינאז מופחתים, NBs אינם מצליחים להפעיל מחדש וצמיחה של גליה וקשת הנשימה מופחתים גם 10,11,15,16. המודל הנוכחי מניח כי הפעלה מחדש של NB מצמידה לצמיחת הזחל על ידי גוף השומן, אשר משחרר אות מערכתי בתגובה להאכלת בעלי חיים 12,17,18. אות זה, שנותר חמקמק, מקדם ככל הנראה את הביטוי והשחרור של פפטיד דמוי אינסולין Drosophila (Dilps) במוח, מה שמוביל להפעלה במורד הזרם של PI3-קינאז ב- NBs ואת נישה גליה וקנה הנשימה שלהם. כדי להבין טוב יותר את טבעם של הסימנים המערכתיים, פיתחנו שיטה להפעלה מחדש של NBs רגיעה בביטויי מוח מתורבתים. בשיטה זו, ניתן לבצע הפעלה מחדש של NBs בהיעדר רמזים מערכתיים של בעלי חיים שלמים. גורמים אקסוגניים יכולים להיות resupplied לתקשורת התרבות ואת NB הפעלה מחדש נבדק בהתבסס על שילוב של אנלוגי thymidine, EdU. בשיטה זו, קבענו כי אינסולין אקסוגני מספיק כדי להפעיל מחדש NBs רגיעה ב explants המוח. עבודה עתידית תהיה מכוונת לזהות גורמים נוספים, אשר, כאשר מתווספים בחזרה, או חיובי או שלילי לווסת את ההשבתה NB ב explants המוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן כדי לתרבות המוח explants יכול להתבצע ברוב סביבות המעבדה. הכלים הנדרשים, כמו גם ההליך ואיסוף הנתונים, הם פשוטים ופשוטים. בשיטה זו, ניתן לבדוק מגוון של השערות, כולל אלה הקשורות מפלי איתות התא וגורמים חיצוניים המסדירים הפעלה מחדש של NB והתפשטות. כאן, באמצעות חיות אורגוןR מסוג בר, מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתוכנית LSAMP Bridges to Phate למימון (CNK) כמו גם NIH/ NIGMS (R01-GM120421 ו- R35-GM141886). אנו מודים לד”ר קונור סייפ על איור 1. אנו מודים גם לכל חברי המעבדה של סיגריסט על תמיכתם המתמשכת והחונכות שלהם. אנו מודים במיוחד לצ’אבי סוד וגארי טיטרס על הקריאה הקפדנית של כתב היד ועל מתן הערות.
Materials
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Gilson | P200 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
- Suman, S., Domingues, A., Ratajczak, J., Ratajczak, M. Z. Potential clinical applications of stem cells in regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1201, 1-22 (2019).
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Daley, G. Q. Stem cells and the evolving notion of cellular identity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 20140376 (2015).
- Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99, 665-706 (2019).
- van Velthoven, C. T. J., Rando, T. A. Stem cell quiescence: Dynamism, restraint, and cellular idling. Cell Stem Cell. 24, 213-225 (2019).
- Chapman, N. M., Boothby, M. R., Chi, H. Metabolic coordination of T cell quiescence and activation. Nature Reviews Immunology. 20, 55-70 (2020).
- Wosczyna, M. N., Rando, T. A. A muscle stem cell support group: Coordinated cellular responses in muscle regeneration. Developmental Cell. 46, 135-143 (2018).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139, 4297-4310 (2012).
- Kang, K. H., Reichert, H. Control of neural stem cell self-renewal and differentiation in Drosophila. Cell and Tissue Research. 359, 33-45 (2015).
- Chell, J. M., Brand, A. H. Nutrition-responsive glia control exit of neural stem cells from quiescence. Cell. 143, 1161-1173 (2010).
- Sousa-Nunes, R., Yee, L. L., Gould, A. P. Fat cells reactivate quiescent neuroblasts via TOR and glial insulin relays in Drosophila. Nature. 471, 508-512 (2011).
- Britton, J. S., Edgar, B. A. Environmental control of the cell cycle in Drosophila: nutrition activates mitotic and endoreplicative cells by distinct mechanisms. Development. 125, 2149-2158 (1998).
- Lin, S., et al. Extremes of lineage plasticity in the Drosophila brain. Current biology : CB. 23, 1908-1913 (2013).
- Sipe, C. W., Siegrist, S. E. Eyeless uncouples mushroom body neuroblast proliferation from dietary amino acids in Drosophila. Elife. 6, 26343 (2017).
- Speder, P., Brand, A. H. Systemic and local cues drive neural stem cell niche remodelling during neurogenesis in Drosophila. Elife. 7, 30413 (2018).
- Yuan, X., Sipe, C. W., Suzawa, M., Bland, M. L., Siegrist, S. E. Dilp-2-mediated PI3-kinase activation coordinates reactivation of quiescent neuroblasts with growth of their glial stem cell niche. PLoS Biology. 18, 3000721 (2020).
- Colombani, J., et al. A nutrient sensor mechanism controls Drosophila growth. Cell. 114, 739-749 (2003).
- Geminard, C., Rulifson, E. J., Leopold, P. Remote control of insulin secretion by fat cells in Drosophila. Cell Metabolism. 10, 199-207 (2009).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Molecular Biology of the Cell. 16, 5127-5140 (2005).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e4270 (2012).
- Bostock, M. P., et al. An immobilization technique for long-term time-lapse imaging of explanted drosophila tissues. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 590094 (2020).
- Datta, S. Activation of neuroblast proliferation in explant culture of the Drosophila larval CNS. Brain Research. 818, 77-83 (1999).
