Konfokal billeddannelse med høj gennemstrømning af kvantepunkt-konjugerede SARS-CoV-2 spike-trimmere til at spore binding og endocytose i HEK293T-celler
Summary
I denne protokol muliggør kvantepunkter konjugeret til rekombinant SARS-CoV-2-spike cellebaserede assays at overvåge spikebinding til hACE2 ved plasmamembranen og efterfølgende endocytose af de bundne proteiner i cytoplasmaet.
Abstract
Udviklingen af nye teknologier til cellulær fluorescensmikroskopi har lettet screeningsmetoder med høj kapacitet til lægemiddelopdagelse. Kvantepunkter er fluorescerende nanopartikler med fremragende fotofysiske egenskaber gennemsyret af lys og stabil fotoluminescens samt smalle emissionsbånd. Kvanteprikker er sfæriske i form, og med den rette modifikation af overfladekemien kan de bruges til at konjugere biomolekyler til cellulære applikationer. Disse optiske egenskaber kombineret med evnen til at funktionalisere dem med biomolekyler gør dem til et glimrende værktøj til at undersøge receptor-ligandinteraktioner og cellulær handel. Her præsenterer vi en metode, der bruger kvanteprikker til at spore bindingen og endocytosen af SARS-CoV-2 spike-protein. Denne protokol kan bruges som en vejledning til eksperimentalister, der ønsker at bruge kvantepunkter til at studere protein-protein-interaktioner og menneskehandel i forbindelse med cellulær fysiologi.
Introduction
Fluorescensmikroskopi gør det muligt for forskere at kigge ind i cellens indre arbejde ved hjælp af specialiserede farvestoffer1, genetisk kodede fluorescerende proteiner2 og fluorescerende nanopartikler i form af kvantepunkter (QD’er)3. For det alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus i 2019 (SARS-CoV-2) globale pandemi har forskere anvendt fluorescensmikroskopi til at forstå, hvordan virussen interagerer med cellen både ved plasmamembranen og i cytoplasmaet. For eksempel har forskere været i stand til at få indsigt i bindingen af SARS-CoV-2 Spike-proteinet på virionens overflade til humant angiotensinkonverterende enzym 2 (hACE2) på overfladen af humane celler, efterfølgende internalisering via fusion ved plasmamembranen og endocytose af Spike: hACE2-proteinkomplekset4,5. Der er også opnået stor indsigt i SARS-CoV-2-udgang fra celler via lysosomet ved hjælp af cellulær fluorescensbilleddannelse, et unikt træk ved coronavirus, der tidligere blev anset for at forekomme via traditionel vesikel, der spirer fra Golgi, som det er med mange andre vira6. En grundpille i næsten alle aspekter af biologisk forskning, den cellulære fluorescensmikroskopiteknik har nødvendigvis udviklet sig i sin bredde og anvendelsesområde fra superopløsningsbilleddannelse af hele dyr til automatiseret multiparametrisk billeddannelse med højt indhold til lægemiddelscreening. Her anvendes automatiseret konfokalmikroskopi med højt indhold til undersøgelsen af SARS-CoV-2-celleindgang ved hjælp af fluorescerende QD’er konjugeret til det virale spikeprotein.
Højindholdsanalyse af billeder genereret af biologiske billeddannelsesplatforme giver mulighed for større udvinding af værdifuld biologisk indsigt end enkeltparametre såsom helbrøndeintensitet, som man ville opnå ved hjælp af en multimodal pladelæser7. Ved at adskille objekterne i et synsfelt ved hjælp af automatiserede segmenteringsalgoritmer kan hvert objekt eller en population af objekter analyseres for parametre som intensitet, areal og tekstur i hver tilgængelig fluorescenskanal8. Kombination af mange målinger i multivariate datasæt er en nyttig tilgang til fænotypisk profilering. Når den ønskede fænotype er kendt, såsom QD-internalisering i form af puncta, kan man bruge målingerne relateret til puncta såsom størrelse, antal og intensitet til at vurdere effekten af en behandling.
Cloudbaseret billedanalysesoftware med højt indhold kan rumme et stort udvalg af instrumentdataudgange, herunder billedbehandlingsplatformen med højt indhold. Ved at bruge en skybaseret server til billedlagring og onlineanalyse kan brugeren uploade sine data fra enten billedbehandlingsinstrumentet eller fra det netværksdrev, hvor dataene er gemt. Analysedelen af protokollen udføres i cloud-softwaremiljøet, og data kan eksporteres i en række filformater til downstream-datavisualisering.
SARS-CoV-2-viruset består af ikke-strukturelle og strukturelle proteiner, der hjælper med dets samling og replikation. SARS-CoV-2 spike har to domæner kaldet S1 og S2, hvor S1 indeholder det receptorbindende domæne, der er ansvarlig for hACE2-interaktioner ved plasmamembranen9. Spike har også vist sig at interagere med andre molekyler ved plasmamembranen, der kan fungere som co-receptorer ud over hACE210,11. I hele spikeproteinsekvensen og især ved S1/S2-grænsefladen er der proteasespaltningssteder, der muliggør fusion ved membranen efter transmembranserinprotease 2 (TMPRSS2)12. Forskellige rekombinante SARS-CoV-2 Spike-proteiner er blevet produceret fra individuelle receptorbindingsdomæner til S1, S2, S1 med S2 og hele spike-trimere fra flere kommercielle leverandører til brug i forskningsaktiviteter13.
I dette arbejde blev overfladen af QD’er funktionaliseret med rekombinante spike trimers, der indeholder et histidin tag (QD-Spike). QD’erne produceret af Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section indeholder en cadmiumselenidkerne og en zinksulfidskal14,15. Zinket på QD-overfladen koordinerer histidinresterne i det rekombinante protein for at danne en funktionaliseret QD, der ligner en SARS-CoV-2 viral partikel i form og funktion. Dannelsen af nanopartiklerne og proteinkonjugeringen blev tidligere beskrevet ved anvendelse af det QD-konjugerede receptorbindingsdomæne15. Denne metode beskriver cellekulturpræparater, QD-behandling, billedoptagelse og dataanalyseprotokol, der kan guide en forsker i at studere SARS-CoV-2 Spike-aktivitet i den fysiologiske sammenhæng med en menneskelig celle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden beskrevet i denne artikel giver de nødvendige trin til billeddannelse af funktionaliserede QD’er i humane celler ved hjælp af konfokal mikroskopi med høj gennemstrømning. Denne metode er bedst egnet til celler, hvor endocytose er den vigtigste indgangsvej snarere end aktiviteten af TMPRSS2 og membranfusion, da den muliggør undersøgelse af SARS-CoV-2 Spike og hACE2 endocytose. På grund af QD-modellens karakter og C-terminal His-tag på den kommercielt tilgængelige Spike-trimer vil enhver TMPRSS2-spaltning …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev delvist støttet af intramural forskningsprogrammet fra National Center for Advancing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory ydede finansiering via sit interne Nanoscience Institute. Reagensforberedelse blev støttet via NRL’s covid-19-basisfond.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
