量子点偶联SARS-CoV-2穗状三聚体的高通量共聚焦成像，以追踪HEK293T细胞中的结合和内吞作用

Summary

在该协议中，与重组SARS-CoV-2尖峰偶联的量子点使基于细胞的测定能够监测质膜上与hACE2的尖峰结合以及随后结合蛋白进入细胞质的内吞作用。

Abstract

细胞荧光显微镜新技术的发展促进了药物发现的高通量筛选方法。量子点是荧光纳米粒子，具有优异的光物理特性，具有明亮稳定的光致发光以及窄发射带。量子点呈球形，通过对表面化学的适当修饰，可用于共轭生物分子用于细胞应用。这些光学特性，加上用生物分子使它们功能化的能力，使它们成为研究受体 - 配体相互作用和细胞运输的绝佳工具。在这里，我们提出了一种使用量子点来跟踪SARS-CoV-2刺突蛋白的结合和内吞作用的方法。该协议可以用作实验者的指南，这些实验者希望利用量子点在细胞生理学的背景下研究蛋白质 - 蛋白质相互作用和运输。

Introduction

荧光显微镜使研究人员能够使用专门的染料¹，遗传编码的荧光蛋白²和量子点（QDs）形式的荧光纳米颗粒³来观察细胞的内部运作。对于2019年严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）全球大流行，研究人员利用荧光显微镜来了解病毒如何在质膜和细胞质中与细胞相互作用。例如，研究人员已经能够深入了解病毒体表面的SARS-CoV-2 Spike蛋白与人类细胞表面的人血管紧张素转换酶2（hACE2）的结合，随后 通过 质膜融合的内化以及Spike:hACE2蛋白复合物的内吞作用^4，5。使用细胞荧光成像对SARS-CoV-2 通过 溶酶体从细胞中流出也有很好的见解，这是冠状病毒的一个独特特征，以前被认为是 通过 高尔基体的传统囊泡萌芽发生的，就像许多其他病毒一样⁶。作为生物学研究几乎所有方面的支柱，细胞荧光显微镜技术在其应用的广度和范围上必然得到发展，从整个动物的超分辨率成像到用于药物筛选的自动高内涵多参数成像。在这里，自动高内涵共聚焦显微镜应用于使用与病毒刺突蛋白偶联的荧光量子点研究SARS-CoV-2细胞进入。

对生物成像平....

Protocol

本研究中使用的HEK293T细胞系是一种永生化的细胞系。本研究未使用人类或动物受试者。

1. 细胞培养和接种

1. 在无菌生物安全柜内，穿着个人防护设备（包括实验室手套、实验室外套和安全眼镜），通过用10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）和250μg/mL G418补充Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）来制备细胞培养基。
   1. 对于 500 mL 培养基，加入 443.75 mL DMEM、50 mL FBS、5 mL P/S 和 1.25 mL G418。
   2. 通过0.2μm过滤瓶过滤并保持无菌性，以避免细菌污染。
2. 在无菌生物安全柜内，将黑色透明底部聚-D-赖氨酸包衣的96孔板内部接种60孔，每孔细胞培养基100μL，其中20，000个细胞。用每孔100μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）填充外部36孔。
   1. 为了计数细胞，将2μL吖啶橙和碘化丙啶染色剂加入18μL细胞悬浮液中。
   2. 将10μL该溶液加载到细胞计数载玻片的一侧。
   3. 重复步骤 1.2.1。和 1.2.2.以加载幻灯片的两侧。
   4. 将载玻片放入自动细胞计数器中。
   5. 选择荧光计数方案，然后按 计数。计算载玻片的两侧并计算两个活细胞密度的平均值。
   ....

Results

在治疗后，量子点将被内化，因为纳米颗粒将与质膜上的ACE2结合并诱导内吞作用。使用表达ACE2-GFP的细胞系，可以使用荧光显微镜观察量子点和ACE2的易位。一旦内化，两个QD和ACE2信号显示出强烈的共定位。从这些图像中，可以执行图像分割和后续分析以提取相关参数，例如点计数（图1， 图2B）。 图1A 是用不同浓度的QD-Spike或培养基仅作为对照处理的细胞的蒙太奇。使用了三个通道，包括数字相衬，FITC和定制QD通道，激发波长为405 nm，发射波长为608 nm。DPC 提供一般像元形状的图像。DPC图像提供了整个细胞形态的近似指示。感兴趣区域与DPC信号重叠，足以检测内化量子点。FITC 通道显示 ACE2-GFP 在与 QD-Spike 共定位的区域中不断变化的本地化和累积。随着量子点尖峰浓度的降低，量子点不再可见，ACE2-GFP信号类似于对照。合并通道演示了 ACE2-GFP 与 QD-Spike 的共定位。这些物体是斑点和较大堆积物的混合物，.......

Discussion

本文中描述的方法为使用高通量共聚焦显微镜对人细胞中的功能化量子点进行成像提供了必要的步骤。该方法最适合于内吞作用是病毒进入的主要途径而不是TMPRSS2和膜融合的活性的细胞，因为它可以研究SARS-CoV-2 Spike和hACE2内吞作用。由于QD模型的性质和市售Spike三聚体上的C端His-tag，Spike S1和S2结构域的任何TMPRSS2切割都将使QD仅附着在S2结构域¹²上。这可能会阻止内部化，因为 RBD 位于 S1 中。因此，如果细胞表面的事件序列是精确的，其中hACE2被结合，然后TMPRSS2切割Spike，则预计会出现没有内化的负信号。

由于该协议处理成像细胞过程，因此培养的细胞必须允许表达hACE2的病毒感染。hACE2可以瞬时转染到细胞中，或者可以产生表达hACE2的稳定细胞系¹⁷。建议使用免疫荧光和针对 hACE2 的抗体来验证 hACE2 的表达和定位，除非 hACE2 具有荧光蛋白标签（如 GFP），可以使用显微镜观察。GFP 标记的 hACE2 赋予.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
32% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15714	用于量子点处理后的细胞固定，终浓度 3.2% 用于稳定 Optimem I 中的 QD 并防止非特异性相互作用，终浓度 0.1%
7.5% 牛血清白蛋白	Gibco	15260-037	用作细胞活力染料，用于荧光细胞计数
吖啶橙/碘化丙啶染料	Logos Biosystems	F23001	微孔板，用于接种细胞和检测 QD-Spike
黑色透明底 96 孔涂层板，包被有聚-D-赖氨酸	Greiner	655946	用于支持细胞培养、DMEM 补充剂
特征胎牛血清	Cytiva/HyClone	SH30071.03	基于云的高内涵图像分析软件;V2.9.1
哥伦布分析仪	Perkin Elmer	NA	用于标记固定后的细胞核和细胞体，深红色核染料
DRAQ5 （5 mM）	ThermoFisher Scientific	62252	用于HEK293T细胞培养的基础培养基
Dulbecco 最低必需培养基，D-葡萄糖 （4.5g/L），L-谷氨酰胺，丙酮酸钠 （110 mg/L），酚红	Gibco	11995-065	用于排列从 Columbus 导出后的数据;V2110 Microsoft 365
Excel	Microsoft	NA	用于继续选择 hACE2-GFP 阳性细胞，DMEM 补充剂
G418	InvivoGen	ant-gn-5	人胚胎肾细胞系稳定表达用 GFP 标记的人血管紧张素转换酶 2
HEK293T hACE2-GFP	Codex Biosolutions	CB-97100-203	自动细胞计数仪
Luna 自动细胞计数仪	Logos Biosystems	NA	用于荧光细胞计数
Luna 细胞计数载玻片	Logos Biosystems	L12001	高内涵成像平台
Opera Phenix	Perkin Elmer	NA	成像培养基，用于用量子点孵育细胞
Opti-MEM I 减血清培养基	Gibco	11058-021	不含钙或镁的磷酸盐缓冲盐水，用于传代和检测过程中洗涤细胞
PBS -/-	Gibco	10010-023	用于防止细胞培养物、DMEM 补充剂
青霉素 链霉素	Gibco	15140-122	用于绘图、数据可视化和统计分析;V9.1.0
Prism	GraphPad	NA	用于检测 SARS-Cov-2 刺突与 hACE2 的结合并监测刺突内吞作用
点 608 nm-Spike （QD608-Spike）	海军研究实验室		用于抑制 SARS-Cov-2 刺突与 hACE2 的结合
SARS-CoV-2 （2019-nCoV） 刺突中和抗体，小鼠单克隆	义翘神州	40592-MM57	用于在传代过程中从培养瓶中解离
TrypLE Express	Gibco	12605-010