Imágenes confocales de alto rendimiento de trímeros de púas de SARS-CoV-2 conjugados con puntos cuánticos para rastrear la unión y la endocitosis en células HEK293T
Summary
En este protocolo, los puntos cuánticos conjugados con el pico recombinante del SARS-CoV-2 permiten que los ensayos basados en células monitoreen la unión del pico a hACE2 en la membrana plasmática y la posterior endocitosis de las proteínas unidas al citoplasma.
Abstract
El desarrollo de nuevas tecnologías para la microscopía de fluorescencia celular ha facilitado métodos de detección de alto rendimiento para el descubrimiento de fármacos. Los puntos cuánticos son nanopartículas fluorescentes con excelentes propiedades fotofísicas imbuidas de fotoluminiscencia brillante y estable, así como de bandas de emisión estrechas. Los puntos cuánticos son de forma esférica, y con la modificación adecuada de la química de la superficie, se pueden utilizar para conjugar biomoléculas para aplicaciones celulares. Estas propiedades ópticas, combinadas con la capacidad de funcionalizarlas con biomoléculas, las convierten en una excelente herramienta para investigar las interacciones receptor-ligando y el tráfico celular. Aquí, presentamos un método que utiliza puntos cuánticos para rastrear la unión y endocitosis de la proteína espiga del SARS-CoV-2. Este protocolo se puede utilizar como una guía para los experimentalistas que buscan utilizar puntos cuánticos para estudiar las interacciones proteína-proteína y el tráfico en el contexto de la fisiología celular.
Introduction
La microscopía de fluorescencia permite a los investigadores observar el funcionamiento interno de la célula utilizando colorantes especializados1, proteínas fluorescentes codificadas genéticamente2 y nanopartículas fluorescentes en forma de puntos cuánticos (QD)3. Para la pandemia mundial del coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo de 2019 (SARS-CoV-2), los investigadores han empleado la microscopía de fluorescencia para comprender cómo el virus interactúa con la célula tanto en la membrana plasmática como en el citoplasma. Por ejemplo, los investigadores han podido obtener información sobre la unión de la proteína Espiga del SARS-CoV-2 en la superficie del virión a la enzima convertidora de angiotensina humana 2 (hACE2) en la superficie de las células humanas, la internalización posterior a través de la fusión en la membrana plasmática y la endocitosis del complejo proteico Spike:hACE24,5. También se han obtenido grandes conocimientos sobre la salida del SARS-CoV-2 de las células a través del lisosoma utilizando imágenes de fluorescencia celular, una característica única de los coronavirus que anteriormente se pensaba que ocurrían a través de la vesícula tradicional que brota del Golgi, como ocurre con muchos otros virus6. Un pilar de casi todos los aspectos de la investigación biológica, la técnica de microscopía de fluorescencia celular ha avanzado necesariamente en su amplitud y alcance de aplicaciones, desde imágenes de superresolución de animales enteros hasta imágenes multiparamétricas automatizadas de alto contenido para la detección de drogas. Aquí, la microscopía confocal automatizada de alto contenido se aplica al estudio de la entrada de células del SARS-CoV-2 utilizando QD fluorescentes conjugados con la proteína espiga viral.
El análisis de alto contenido de las imágenes generadas por las plataformas de imágenes biológicas permite una mayor extracción de valiosos conocimientos biológicos que los parámetros individuales, como la intensidad de todo el pozo, que se obtendría utilizando un lector de placas multimodal7. Al separar los objetos en un campo de visión utilizando algoritmos de segmentación automatizados, cada objeto o una población de objetos se puede analizar en busca de parámetros como la intensidad, el área y la textura en cada canal de fluorescencia disponible8. La combinación de muchas mediciones en conjuntos de datos multivariados es un enfoque útil para la elaboración de perfiles fenotípicos. Cuando se conoce el fenotipo deseado, como la internalización de QD en forma de puntcta, se pueden usar las mediciones relacionadas con puncta como el tamaño, el número y la intensidad para evaluar la eficacia de un tratamiento.
El software de análisis de imágenes de alto contenido basado en la nube puede acomodar una gran variedad de salidas de datos de instrumentos, incluida la plataforma de imágenes de alto contenido. Mediante el uso de un servidor basado en la nube para el almacenamiento de imágenes y el análisis en línea, el usuario puede cargar sus datos desde el instrumento de imágenes o desde la unidad de red donde se almacenan los datos. La parte de análisis del protocolo se lleva a cabo dentro del entorno de software en la nube, y los datos se pueden exportar en una variedad de formatos de archivo para la visualización de datos posteriores.
El virus SARS-CoV-2 está compuesto por proteínas no estructurales y no estructurales que ayudan en su ensamblaje y replicación. El pico del SARS-CoV-2 tiene dos dominios llamados S1 y S2, con S1 que contiene el dominio de unión al receptor responsable de las interacciones hACE2 en la membrana plasmática9. También se ha encontrado que Spike interactúa con otras moléculas en la membrana plasmática que pueden actuar como co-receptores además de hACE210,11. A lo largo de la secuencia de proteínas espiga y particularmente en la interfaz S1/S2, hay sitios de escisión de la proteasa que permiten la fusión en la membrana después de la serina proteasa transmembrana 2 (TMPRSS2)12. Se han producido varias proteínas recombinantes de pico de SARS-CoV-2 a partir de dominios de unión a receptores individuales, a S1, S2, S1 con S2 y trímeros de pico enteros de múltiples proveedores comerciales para su uso en actividades de investigación13.
En este trabajo, la superficie de los QD se funcionalizó con trímeros de pico recombinantes que contienen una etiqueta de histidina (QD-Spike). Los QD producidos por la Sección de Nanomateriales Ópticos del Laboratorio de Investigación Naval contienen un núcleo de seleniuro de cadmio y una carcasa de sulfuro de zinc14,15. El zinc en la superficie QD coordina los residuos de histidina dentro de la proteína recombinante para formar un QD funcionalizado que se asemeja a una partícula viral del SARS-CoV-2 en forma y función. La generación de las nanopartículas y la conjugación de proteínas se describió previamente utilizando el dominio de unión al receptor conjugado QD15. Este método describe las preparaciones de cultivo celular, el tratamiento QD, la adquisición de imágenes y el protocolo de análisis de datos que pueden guiar a un investigador en el estudio de la actividad del pico del SARS-CoV-2 en el contexto fisiológico de una célula humana.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método descrito en este artículo proporciona los pasos necesarios para obtener imágenes de QD funcionalizados en células humanas mediante microscopía confocal de alto rendimiento. Este método es más adecuado para las células donde la endocitosis es la principal vía de entrada viral en lugar de la actividad de TMPRSS2 y la fusión de membrana, ya que permite el estudio de la endocitosis del pico del SARS-CoV-2 y la endocitosis hACE2. Debido a la naturaleza del modelo QD y la etiqueta C-terminal His-tag en el t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada en parte por el Programa de Investigación Intramuros del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales, NIH. El Laboratorio de Investigación Naval proporcionó fondos a través de su Instituto de Nanociencia interno. La preparación de reactivos se apoyó a través del fondo base NRL COVID-19.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
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