HEK293T Hücrelerinde Bağlanma ve Endositozu İzlemek için Kuantum Nokta Konjuge SARS-CoV-2 Spike Trimerlerinin Yüksek Verimli Konfokal Görüntülemesi
Summary
Bu protokolde, rekombinant SARS-CoV-2 spike’a konjuge edilen kuantum noktaları, hücre bazlı testlerin, plazma zarındaki hACE2’ye ve ardından bağlı proteinlerin sitoplazmaya endositozunu izlemek için hücre bazlı tahlilleri izlemesini sağlar.
Abstract
Hücresel floresan mikroskobu için yeni teknolojilerin geliştirilmesi, ilaç keşfi için yüksek verimli tarama yöntemlerini kolaylaştırmıştır. Kuantum noktaları, parlak ve kararlı fotolüminesansın yanı sıra dar emisyon bantları ile aşılanmış mükemmel fotofiziksel özelliklere sahip floresan nanopartiküllerdir. Kuantum noktaları şekil olarak küreseldir ve yüzey kimyasının uygun modifikasyonu ile hücresel uygulamalar için biyomolekülleri konjuge etmek için kullanılabilir. Bu optik özellikler, onları biyomoleküllerle işlevselleştirme yeteneği ile birleştiğinde, onları reseptör-ligand etkileşimlerini ve hücresel kaçakçılığı araştırmak için mükemmel bir araç haline getirir. Burada, SARS-CoV-2 spike proteininin bağlanmasını ve endositozunu izlemek için kuantum noktaları kullanan bir yöntem sunuyoruz. Bu protokol, protein-protein etkileşimlerini ve hücresel fizyoloji bağlamında kaçakçılığı incelemek için kuantum noktalarını kullanmak isteyen deneyciler için bir rehber olarak kullanılabilir.
Introduction
Floresan mikroskobu, araştırmacıların özel boyalar1, genetik olarak kodlanmış floresan proteinleri2 ve kuantum noktaları (QD’ler)3 şeklinde floresan nanopartiküller kullanarak hücrenin iç işleyişine bakmalarını sağlar. 2019’un şiddetli akut solunum sendromu koronavirüsü (SARS-CoV-2) küresel pandemisi için araştırmacılar, virüsün hem plazma zarında hem de sitoplazmada hücre ile nasıl etkileşime girdiğini anlamak için floresan mikroskobu kullandılar. Örneğin, araştırmacılar, viryonun yüzeyindeki SARS-CoV-2 Spike proteininin, insan hücrelerinin yüzeyindeki insan anjiyotensin dönüştürücü enzim 2’ye (hACE2) bağlanması, plazma zarında füzyon yoluyla daha sonra içselleştirilmesi ve Spike: hACE2 protein kompleksinin endositozu hakkında bilgi edinebildiler4,5. SARS-CoV-2’nin hücresel floresan görüntüleme kullanılarak lizozom yoluyla hücrelerden çıkışı hakkında da büyük bilgiler edinilmiştir; bu, daha önce diğer birçok virüste olduğu gibi, Golgi’den geleneksel vezikül tomurcuklanması yoluyla meydana geldiği düşünülen koronavirüslerin benzersiz bir özelliğidir6. Biyolojik araştırmanın hemen hemen tüm yönlerinin dayanak noktası olan hücresel floresan mikroskopi tekniği, tüm hayvanların süper çözünürlüklü görüntülemesinden, ilaç taraması için otomatik yüksek içerikli multi-parametrik görüntülemeye kadar uygulamaların genişliğinde ve kapsamında mutlaka ilerlemiştir. Burada, viral spike proteinine konjuge floresan QD’ler kullanılarak SARS-CoV-2 hücre girişinin incelenmesine otomatik yüksek içerikli konfokal mikroskopi uygulanır.
Biyolojik görüntüleme platformları tarafından üretilen görüntülerin yüksek içerikli analizi, değerli biyolojik içgörülerin, çok modlu bir plaka okuyucu kullanılarak elde edilebilecek tam kuyu yoğunluğu gibi tek parametrelerden daha fazla çıkarılmasına olanak tanır7. Otomatik segmentasyon algoritmaları kullanılarak bir görüş alanındaki nesneler ayrılarak, her nesne veya nesne popülasyonu, mevcut her floresan kanalındaki yoğunluk, alan ve doku gibi parametreler için analiz edilebilir8. Birçok ölçümü çok değişkenli veri kümelerinde birleştirmek, fenotipik profil oluşturma için yararlı bir yaklaşımdır. Puntta şeklinde QD içselleştirme gibi istenen fenotip bilindiğinde, bir tedavinin etkinliğini değerlendirmek için boyut, sayı ve yoğunluk gibi puncta ile ilgili ölçümler kullanılabilir.
Bulut tabanlı yüksek içerikli görüntüleme analiz yazılımı, yüksek içerikli görüntüleme platformu da dahil olmak üzere çok çeşitli cihaz veri çıkışlarını barındırabilir. Görüntü depolama ve çevrimiçi analiz için bulut tabanlı bir sunucu kullanarak, kullanıcı verilerini görüntüleme cihazından veya verilerin depolandığı ağ sürücüsünden yükleyebilir. Protokolün analiz kısmı bulut yazılım ortamında gerçekleştirilir ve veriler, aşağı akış veri görselleştirmesi için çeşitli dosya biçimlerinde dışa aktarılabilir.
SARS-CoV-2 virüsü, montajına ve replikasyonuna yardımcı olan yapısal olmayan ve yapısal proteinlerden oluşur. SARS-CoV-2 spike, plazma zarındaki hACE2 etkileşimlerinden sorumlu reseptör bağlayıcı alanı içeren S1 ile S1 ve S2 adı verilen iki alana sahiptir9. Spike’ın ayrıca plazma zarında hACE210,11’e ek olarak ko-reseptörler olarak işlev görebilecek diğer moleküllerle etkileşime girdiği bulunmuştur. Spike protein dizisi boyunca ve özellikle S1 / S2 arayüzünde, transmembran serin proteaz 2 (TMPRSS2) 12’den sonra membranda füzyonu sağlayan proteaz bölünme bölgeleri vardır. Araştırma faaliyetlerinde kullanılmak üzere bireysel reseptör bağlanma alanlarından S1, S2, S1’e ve araştırma faaliyetlerinde kullanılmak üzere birden fazla ticari satıcıdan tüm başak düzelticilere çeşitli rekombinant SARS-CoV-2 Spike proteinleri üretilmiştir13.
Bu çalışmada, QD’lerin yüzeyi, histidin etiketi (QD-Spike) içeren rekombinant spike trimers ile işlevselleştirilmiştir. Deniz Araştırma Laboratuvarı Optik Nanomalzemeler Bölümü tarafından üretilen QD’ler bir kadmiyum selenit çekirdeği ve bir çinko sülfür kabuğu içerir14,15. QD yüzeyindeki çinko, form ve işlev olarak SARS-CoV-2 viral parçacığına benzeyen işlevselleştirilmiş bir QD oluşturmak için rekombinant protein içindeki histidin kalıntılarını koordine eder. Nanopartiküllerin ve protein konjugasyonunun oluşumu daha önce QD-konjuge reseptör bağlanma alanı kullanılarak tanımlanmıştır15. Bu yöntem, bir insan hücresinin fizyolojik bağlamında SARS-CoV-2 Spike aktivitesini incelemede bir araştırmacıya rehberlik edebilecek hücre kültürü preparatlarını, QD tedavisini, görüntü elde etmeyi ve veri analizi protokolünü açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede açıklanan yöntem, yüksek verimli konfokal mikroskopi kullanarak insan hücrelerinde işlevselleştirilmiş QD’lerin görüntülenmesi için gerekli adımları sağlar. Bu yöntem, SARS-CoV-2 Spike ve hACE2 endositozunun incelenmesini mümkün kıldığı için, endositozun TMPRSS2 ve membran füzyonunun aktivitesinden ziyade viral girişin ana yolu olduğu hücreler için en uygun yöntemdir. QD modelinin ve ticari olarak temin edilebilen Spike trimerindeki C-terminal His-etiketinin doğası gereği, Spik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma kısmen Ulusal Translasyonel Bilimleri Geliştirme Merkezi, NIH’nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Deniz Araştırma Laboratuvarı, dahili Nanobilim Enstitüsü aracılığıyla finansman sağladı. Reaktif hazırlığı NRL COVID-19 temel fonu aracılığıyla desteklenmiştir.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
