Konfokal avbildning av kvantpunkt-konjugerad SARS-CoV-2 spike trimers för att spåra bindning och endocytos i HEK293T-celler
Summary
I detta protokoll, kvantprickar konjugerade till rekombinanta SARS-CoV-2 spike gör det möjligt cellbaserade analyser att övervaka spikbindning till hACE2 vid plasmamembranet och efterföljande endocytos av de bundna proteinerna i cytoplasman.
Abstract
Utvecklingen av ny teknik för cellulär fluorescensmikroskopi har underlättat screeningmetoder med hög genomströmning för läkemedelsupptäckt. Kvantprickar är fluorescerande nanopartiklar med utmärkta fotofysiska egenskaper genomsyrade av ljus och stabil fotoluminescens samt smala emissionsband. Kvantprickar är sfäriska i form, och med rätt modifiering av ytkemin kan användas för att konjugera biomolekyler för cellulära applikationer. Dessa optiska egenskaper, i kombination med förmågan att funktionalisera dem med biomolekyler, gör dem till ett utmärkt verktyg för att undersöka receptor-ligand interaktioner och cellulär handel. Här presenterar vi en metod som använder kvantprickar för att spåra bindning och endocytos av SARS-CoV-2 spike protein. Detta protokoll kan användas som en guide för experimentalister som vill använda kvantprickar för att studera protein-proteininteraktioner och trafficking i samband med cellulär fysiologi.
Introduction
Fluorescensmikroskopi gör det möjligt för forskare att kika in i cellens inre funktion med hjälp av specialiserade färgämnen1, genetiskt kodade fluorescerande proteiner2 och fluorescerande nanopartiklar i form av kvantprickar (QDs)3. För den allvarliga akuta respiratoriska syndromet coronaviruset 2019 (SARS-CoV-2) global pandemi har forskare använt fluorescensmikroskopi för att förstå hur viruset interagerar med cellen både vid plasmamembranet och i cytoplasman. Till exempel har forskare kunnat få insikter om bindningen av SARS-CoV-2 Spike-proteinet på virions yta till humant angiotensinkonverteringsenzym 2 (hACE2) på ytan av mänskliga celler, efterföljande internalisering via fusion vid plasmamembranet och endocytos av Spike:hACE2 proteinkomplex4,5. Stora insikter har också erhållits i SARS-CoV-2 utgående från celler via lysosomen med hjälp av cellulär fluorescensavbildning, en unik egenskap hos coronavirus som tidigare troddes inträffa via traditionell vesikel spirande från Golgi, som det är med många andra virus6. Den cellulära fluorescensmikroskopitekniken är en stöttepelare i nästan alla aspekter av biologisk forskning och har nödvändigtvis avancerat i sin bredd och omfattning av tillämpningar från superupplösningsavbildning av hela djur till automatiserad multiparmetrisk avbildning med högt innehåll för läkemedelsscreening. Här tillämpas automatiserad konfokal mikroskopi med högt innehåll på studien av SARS-CoV-2-cellinmatning med fluorescerande QDs konjugerade till virusspikproteinet.
Analys med högt innehåll av bilder som genereras av biologiska bildplattformar möjliggör större extraktion av värdefulla biologiska insikter än enskilda parametrar som hel brunnsintensitet, som man skulle få med hjälp av en multimodal plattläsare7. Genom att separera objekten i ett synfält med hjälp av automatiserade segmenteringsalgoritmer kan varje objekt eller en population av objekt analyseras för parametrar som intensitet, område och textur i varje tillgänglig fluorescenskanal8. Att kombinera många mätningar i multivariata data uppsättningar är en användbar metod för fenotypisk profilering. När den önskade fenotypen är känd, såsom QD internalisering i form av punkta, kan man använda mätningarna relaterade till punktera såsom storlek, antal och intensitet för att bedöma effekten av en behandling.
Molnbaserad programvara för bildanalys med högt innehåll kan rymma ett stort antal instrumentdatautgångar, inklusive plattformen för bildbehandling med högt innehåll. Genom att använda en molnbaserad server för bildlagring och onlineanalys kan användaren ladda upp sina data från antingen bildinstrumentet eller från nätverksenheten där data lagras. Analysdelen av protokollet utförs i moln program miljön och data kan exporteras i en mängd olika fil format för nedströms data visualisering.
SARS-CoV-2-viruset består av icke-strukturella och strukturella proteiner som hjälper till i dess sammansättning och replikering. SARS-CoV-2 spike har två domäner som kallas S1 och S2, där S1 innehåller den receptorbindande domänen som ansvarar för hACE2-interaktioner vid plasmamembranet9. Spike har också visat sig interagera med andra molekyler vid plasmamembranet som kan fungera som co-receptorer utöver hACE210,11. Genom hela spikproteinsekvensen och särskilt vid S1/S2-gränssnittet finns det proteasklyvningsplatser som möjliggör fusion vid membranet efter transmembran serinproteas 2 (TMPRSS2)12. Olika rekombinanta SARS-CoV-2 Spike proteiner har producerats från enskilda receptor bindande domäner, till S1, S2, S1 med S2, och hela spik trimers från flera kommersiella leverantörer för användning i forskningsverksamhet13.
I detta arbete, ytan av QDs funktionaliserades med rekombinanta spik trimers som innehåller en histidin tagg (QD-Spike). QDs som produceras av Naval Research Laboratory Optical Nanomaterials Section innehåller en kadmium selenidkärna och ett zinksulfidskal14,15. Zinken på QD-ytan koordinerar histidinresterna i det rekombinanta proteinet för att bilda en funktionaliserad QD som liknar en SARS-CoV-2 viruspartikel i form och funktion. Genereringen av nanopartiklar och proteinkonjugation beskrevs tidigare med hjälp av QD-konjugerade receptorbindningsdomänen15. Denna metod beskriver cellodlingspreparat, QD-behandling, bildförvärv och dataanalysprotokoll som kan vägleda en forskare i att studera SARS-CoV-2 Spike aktivitet i det fysiologiska sammanhanget för en mänsklig cell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden som beskrivs i den här artikeln ger de nödvändiga stegen för avbildning funktionella QDs i mänskliga celler med hjälp av hög-genomströmning confocal mikroskopi. Denna metod är bäst lämpad för celler där endocytos är huvudvägen för viral inmatning snarare än aktiviteten hos TMPRSS2 och membranfusion, eftersom det möjliggör studier av SARS-CoV-2 Spike och hACE2 endocytos. På grund av QD-modellens natur och C-terminalen His-tag på den kommersiellt tillgängliga Spike-trimern skulle alla TMPRSS2-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes delvis av Intramural Research Program vid National Center for Advanceing Translational Sciences, NIH. Naval Research Laboratory tillhandahöll finansiering via sitt interna nanovetenskapliga institut. Reagensberedningen stöddes via BASFONDEN NRL COVID-19.
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
References
- Chazotte, B. Labeling Lysosomes in Live Cells with LysoTracker. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5571 (2011).
- Mehta, S., Zhang, J. Biochemical activity architectures visualized-using genetically encoded fluorescent biosensors to map the spatial boundaries of signaling compartments. Accounts of Chemical Research. 54 (10), 2409-2420 (2021).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 59 (3), 237-251 (2011).
- Cuervo, N. Z., Grandvaux, N. ACE2: Evidence of role as entry receptor for SARS-CoV-2 and implications in comorbidities. eLife. 9, 61390 (2020).
- Shang, J., et al. Cell entry mechanisms of SARS-CoV-2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (21), 11727-11734 (2020).
- Ghosh, S., et al. β-Coronaviruses use lysosomes for egress instead of the biosynthetic secretory pathway. Cell. 183 (6), 1520-1535 (2020).
- Buchser, W., et al., Markossian, S., et al. Assay development guidelines for image-based high content screening, high content analysis and high content imaging. Assay Guidance Manual. , (2012).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Huang, Y., Yang, C., Xu, X. F., Xu, W., Liu, S. W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1141-1149 (2020).
- Gao, C., et al. SARS-CoV-2 spike protein interacts with multiple innate immune receptors. bioRxiv: the preprint server for biology. , 227462 (2020).
- Zhang, Q., et al. Heparan sulfate assists SARS-CoV-2 in cell entry and can be targeted by approved drugs in vitro. Cell Discovery. 6 (1), 80 (2020).
- Hoffmann, M., et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 181 (2), 271-280 (2020).
- Cai, Y., et al. Distinct conformational states of SARS-CoV-2 spike protein. Science. 369 (6511), 1586-1592 (2020).
- Oh, E., et al. Meta-analysis of cellular toxicity for cadmium-containing quantum dots. Nature Nanotechnology. 11 (5), 479-486 (2016).
- Gorshkov, K., et al. Quantum dot-conjugated SARS-CoV-2 spike pseudo-virions enable tracking of angiotensin Converting enzyme 2 binding and endocytosis. ACS Nano. 14 (9), 12234-12247 (2020).
- Narayanan, S. S., Pal, S. K. Aggregated CdS quantum dots: Host of biomolecular ligands. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (48), 24403-24409 (2006).
- Wang, S., et al. Endocytosis of the receptor-binding domain of SARS-CoV spike protein together with virus receptor ACE2. Virus Research. 136 (1), 8-15 (2008).
- Hildebrandt, N., et al. Energy transfer with semiconductor quantum dot bioconjugates: A versatile platform for biosensing, energy harvesting, and other developing applications. Chemical Reviews. 117 (2), 536 (2017).
