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Biology

क्वांटम डॉट-संयुग्मित SARS-CoV-2 स्पाइक ट्रिमर्स के उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल इमेजिंग HEK293T कोशिकाओं में बाइंडिंग और एंडोसाइटोसिस को ट्रैक करने के लिए

Published: April 21, 2022 doi: 10.3791/63202
Automatic Translation
1, 2, 2,3, 2, 1
1National Center for Advancing Translational Sciences, 2Optical Sciences Division, Code 5600, Naval Research Laboratory, 3Jacobs Corporation

Summary

इस प्रोटोकॉल में, पुनः संयोजक सार्स-कोव-2 स्पाइक के लिए संयुग्मित क्वांटम डॉट्स सेल-आधारित assays को प्लाज्मा झिल्ली पर hACE2 के लिए स्पाइक बाइंडिंग और साइटोप्लाज्म में बाध्य प्रोटीन के बाद के एंडोसाइटोसिस की निगरानी करने में सक्षम बनाते हैं।

Abstract

सेलुलर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए नई प्रौद्योगिकियों के विकास ने दवा की खोज के लिए उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग विधियों की सुविधा प्रदान की है। क्वांटम डॉट्स उत्कृष्ट फोटोफिजिकल गुणों के साथ फ्लोरोसेंट नैनोकणों हैं जो उज्ज्वल और स्थिर फोटोल्यूमिनेसेंस के साथ-साथ संकीर्ण उत्सर्जन बैंड के साथ प्रभावित होते हैं। क्वांटम डॉट्स आकार में गोलाकार होते हैं, और सतह रसायन विज्ञान के उचित संशोधन के साथ, सेलुलर अनुप्रयोगों के लिए बायोमोलेक्यूल्स को संयुग्मित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। ये ऑप्टिकल गुण, बायोमोलेक्यूल्स के साथ उन्हें कार्यात्मक बनाने की क्षमता के साथ संयुक्त हैं, उन्हें रिसेप्टर-लिगैंड इंटरैक्शन और सेलुलर तस्करी की जांच के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण बनाते हैं। यहां, हम एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो सार्स-कोव -2 स्पाइक प्रोटीन के बंधन और एंडोसाइटोसिस को ट्रैक करने के लिए क्वांटम डॉट्स का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगात्मकवादियों के लिए एक गाइड के रूप में किया जा सकता है जो सेलुलर फिजियोलॉजी के संदर्भ में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और तस्करी का अध्ययन करने के लिए क्वांटम डॉट्स का उपयोग करना चाहते हैं।

Introduction

प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी शोधकर्ताओं को विशेष रंगों 1, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन 2, और क्वांटम डॉट्स (क्यूडी) 3 के रूप में फ्लोरोसेंट नैनोकणों का उपयोग करके सेल के आंतरिक कामकाज में सहकर्मी बनाने में सक्षम बनाता है। 2019 (सार्स-कोव -2) वैश्विक महामारी के गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनोवायरस के लिए, शोधकर्ताओं ने यह समझने के लिए प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को नियोजित किया है कि वायरस प्लाज्मा झिल्ली और साइटोप्लाज्म दोनों में कोशिका के साथ कैसे बातचीत करता है। उदाहरण के लिए, शोधकर्ताओं ने मानव कोशिकाओं की सतह पर मानव एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एचएसीई 2) के लिए विषाणु की सतह पर सार्स-कोव -2 स्पाइक प्रोटीन के बंधन में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने में सक्षम किया है, बाद में प्लाज्मा झिल्ली पर संलयन के माध्यम से आंतरिककरण, और स्पाइक के एंडोसाइटोसिस: एचएसीई 2 प्रोटीन कॉम्प्लेक्स 4,5। सेलुलर प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग करके लाइसोसोम के माध्यम से कोशिकाओं से सार्स-कोव -2 के उत्सर्जन में भी महान अंतर्दृष्टि प्राप्त की गई है, कोरोनोवायरस की एक अनूठी विशेषता जो पहले गोल्गी से पारंपरिक पुटिका नवोदित के माध्यम से होने के लिए सोचा गया था, क्योंकि यह कई अन्य वायरस के साथ है। जैविक अनुसंधान के लगभग सभी पहलुओं का एक मुख्य आधार, सेलुलर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक ने आवश्यक रूप से दवा स्क्रीनिंग के लिए स्वचालित उच्च-सामग्री मल्टी-पैरामीट्रिक इमेजिंग के लिए पूरे जानवरों के सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग से अनुप्रयोगों की चौड़ाई और दायरे में उन्नत किया है। यहां, स्वचालित उच्च-सामग्री कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी को वायरल स्पाइक प्रोटीन के लिए संयुग्मित फ्लोरोसेंट क्यूडी का उपयोग करके सार्स-कोव -2 सेल प्रविष्टि के अध्ययन के लिए लागू किया जाता है।

जैविक इमेजिंग प्लेटफार्मों द्वारा उत्पन्न छवियों का उच्च-सामग्री विश्लेषण एकल मापदंडों जैसे कि पूरी तरह से तीव्रता की तुलना में मूल्यवान जैविक अंतर्दृष्टि के अधिक निष्कर्षण की अनुमति देता है, जो एक बहु-मोडल प्लेट रीडर 7 का उपयोग करके प्राप्त करेगा। स्वचालित विभाजन एल्गोरिदम का उपयोग करके दृश्य के क्षेत्र में वस्तुओं को अलग करके, प्रत्येक ऑब्जेक्ट या वस्तुओं की आबादी का विश्लेषण प्रत्येक उपलब्ध प्रतिदीप्ति चैनल 8 में तीव्रता, क्षेत्र और बनावट जैसे मापदंडों के लिए किया जा सकता है। Multivariate datasets में कई मापों का संयोजन फेनोटाइपिक प्रोफाइलिंग के लिए एक उपयोगी दृष्टिकोण है। जब वांछित फेनोटाइप ज्ञात होता है, जैसे कि पंक्टा के रूप में क्यूडी आंतरिककरण, तो कोई भी उपचार की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए आकार, संख्या और तीव्रता जैसे पंक्टा से संबंधित मापों का उपयोग कर सकता है।

क्लाउड-आधारित उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण सॉफ़्टवेयर उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म सहित विभिन्न प्रकार के इंस्ट्रूमेंट डेटा आउटपुट को समायोजित कर सकता है। छवि भंडारण और ऑनलाइन विश्लेषण के लिए क्लाउड-आधारित सर्वर का उपयोग करके, उपयोगकर्ता अपने डेटा को या तो इमेजिंग इंस्ट्रूमेंट से या उस नेटवर्क ड्राइव से अपलोड करने में सक्षम है जहां डेटा संग्रहीत किया जाता है। प्रोटोकॉल का विश्लेषण भाग क्लाउड सॉफ़्टवेयर वातावरण के भीतर आयोजित किया जाता है, और डेटा को डाउनस्ट्रीम डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए विभिन्न प्रकार के फ़ाइल प्रारूपों में निर्यात किया जा सकता है।

सार्स-कोव -2 वायरस गैर-संरचनात्मक और संरचनात्मक प्रोटीन से बना है जो इसकी असेंबली और प्रतिकृति में सहायता करता है। सार्स-कोव -2 स्पाइक में एस 1 और एस 2 नामक दो डोमेन हैं, जिसमें एस 1 में प्लाज्मा झिल्ली 9 पर एचएसीई 2 इंटरैक्शन के लिए जिम्मेदार रिसेप्टर-बाइंडिंग डोमेन होता है। स्पाइक को प्लाज्मा झिल्ली पर अन्य अणुओं के साथ बातचीत करने के लिए भी पाया गया है जो एचएसीई 210,11 के अलावा सह-रिसेप्टर्स के रूप में कार्य कर सकते हैं। स्पाइक प्रोटीन अनुक्रम के दौरान और विशेष रूप से S1 / S2 इंटरफ़ेस पर, प्रोटीज क्लीवेज साइटें हैं जो ट्रांसमेम्ब्रेन सेरीन प्रोटीज 2 (TMPRSS2) 12 के बाद झिल्ली पर संलयन को सक्षम करती हैं। विभिन्न पुनः संयोजक सार्स-कोव -2 स्पाइक प्रोटीन का उत्पादन व्यक्तिगत रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन से किया गया है, एस 1, एस 2 के साथ एस 1, एस 2, और अनुसंधान गतिविधियों में उपयोग के लिए कई वाणिज्यिक विक्रेताओं से पूरे स्पाइक ट्रिमर।

इस काम में, क्यूडी की सतह को पुनः संयोजक स्पाइक ट्रिमर के साथ कार्यात्मक किया गया था जिसमें हिस्टिडीन टैग (क्यूडी-स्पाइक) होता है। नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला ऑप्टिकल नैनोमटेरियल्स अनुभाग द्वारा उत्पादित क्यूडी में एक कैडमियम सेलेनाइड कोर और एक जस्ता सल्फाइड शेल 14,15 शामिल हैं। क्यूडी सतह पर जस्ता पुनः संयोजक प्रोटीन के भीतर हिस्टिडीन अवशेषों का समन्वय करता है ताकि एक कार्यात्मक क्यूडी बनाया जा सके जो रूप और कार्य में सार्स-कोव -2 वायरल कण जैसा दिखता है। नैनोकणों और प्रोटीन संयुग्मन की पीढ़ी को पहले क्यूडी-संयुग्मित रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन 15 का उपयोग करके वर्णित किया गया था। यह विधि सेल संस्कृति की तैयारी, क्यूडी उपचार, छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण प्रोटोकॉल का वर्णन करती है जो मानव सेल के शारीरिक संदर्भ में सार्स-कोव -2 स्पाइक गतिविधि का अध्ययन करने में एक शोधकर्ता का मार्गदर्शन कर सकती है।

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Protocol

इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली HEK293T सेल लाइन एक अमर सेल लाइन है। इस अध्ययन में किसी भी मानव या पशु विषय का उपयोग नहीं किया गया था।

1. सेल culturing और सीडिंग

  1. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला दस्ताने, प्रयोगशाला कोट और सुरक्षा चश्मा सहित) पहने हुए, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), और 250 μg / mL G418 के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के पूरक द्वारा सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें।
    1. 500 मिलीलीटर मीडिया के लिए, डीएमईएम के 443.75 एमएल, एफबीएस के 50 एमएल, पी / एस के 5 एमएल और जी 418 के 1.25 एमएल जोड़ें।
    2. एक 0.2 μm फिल्टर फ्लास्क के माध्यम से फ़िल्टर करें और जीवाणु संदूषण से बचने के लिए बाँझपन बनाए रखें।
  2. एक बाँझ biosafety कैबिनेट के अंदर, एक काले, स्पष्ट नीचे, पॉली-डी-लाइसिन के इंटीरियर 60 कुओं को सेल संस्कृति माध्यम के प्रति 100 μL में 20,000 कोशिकाओं के साथ लेपित 96-अच्छी तरह से प्लेट। फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के प्रति कुएं 100 μL के साथ बाहरी 36 कुओं को भरें।
    1. कोशिकाओं की गणना करने के लिए, सेल निलंबन के 18 μL करने के लिए acridine नारंगी और propidium आयोडाइड दाग के 2 μL जोड़ें।
    2. एक सेल गिनती स्लाइड के एक तरफ में इस समाधान के 10 μL लोड करें।
    3. चरण 1.2.1 दोहराएँ। और 1.2.2. स्लाइड के दोनों किनारों को लोड करने के लिए।
    4. स्लाइड को स्वचालित कक्ष काउंटर में रखें.
    5. प्रतिदीप्ति गिनती प्रोटोकॉल का चयन करें और गिनती दबाएँ। स्लाइड के दोनों किनारों की गणना करें और दो लाइव-सेल घनत्व के औसत की गणना करें।
    6. आवश्यक सेल निलंबन की मात्रा की गणना करने के लिए, औसत सेल घनत्व द्वारा आवश्यक कोशिकाओं की कुल संख्या को विभाजित करें।
  3. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सीडिंग के बाद कुओं का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि उचित घनत्व और वितरण प्राप्त किया गया है।
  4. 5% CO2 के साथ 37 °C पर एक humidified इनक्यूबेटर में रात भर प्लेट को इनक्यूबेट करें।

2. क्यूडी-स्पाइक के साथ कोशिकाओं का उपचार

  1. इमेजिंग मीडिया में पतला करके 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) तैयार करें।
    1. इमेजिंग मीडिया के 10 मिलीलीटर के लिए, 7.5% बीएसए के 130 μL जोड़ें और मिश्रण करें।
  2. एक 12-अच्छी तरह से जलाशय या परख प्लेट में, इमेजिंग मीडिया में 0.1% बीएसए का उपयोग करके 440 एनएम क्यूडी-स्पाइक (सार्स-कोव -2, यूएसए-डब्ल्यूए 1 / 2020 को अलग करें) स्टॉक को 20 एनएम तक पतला करें।
    1. QD-स्पाइक के 1 अच्छी तरह से के लिए, 20 nM की अंतिम एकाग्रता के लिए 0.1% BSA इमेजिंग मीडिया के 47.73 μL करने के लिए 440 nM QD-स्पाइक के 2.27 μL जोड़ें।
    2. एक छह-बिंदु 1: 3 सीरियल कमजोर पड़ने (तीन प्रतियों में) उत्पन्न करने के लिए, 20 एनएम की उच्चतम एकाग्रता बनाने के लिए 0.1% बीएसए इमेजिंग मीडिया के 285.74 μL में QD-स्पाइक के 14.26 μL जोड़ें। 6.67 nM QD-स्पाइक का दूसरा कमजोर पड़ने के लिए 0.1% BSA मीडिया के 200 μL करने के लिए 20 nM QD-स्पाइक के 100 μL जोड़ें। छह एकाग्रता बिंदुओं को उत्पन्न करने के लिए चार बार दोहराएं।
  3. एक बहु-चैनल एस्पिरेटर का उपयोग करके, प्रत्येक अच्छी तरह से सभी खर्च किए गए मीडिया को हटा दें। एक बहु-चैनल पिपेट का उपयोग करके, इमेजिंग मीडिया (100 μL / अच्छी तरह से) के साथ एक बार धोएं।
  4. इमेजिंग मीडिया के एस्पिरेट 100 μL और क्यूडी-स्पाइक समाधान के 50 μL / अच्छी तरह से वापस जोड़ें।
  5. 5% CO2 के साथ 37 °C पर एक humidified इनक्यूबेटर में 3 घंटे के लिए प्लेट इनक्यूबेट करें। चरण 4 पर जारी रखें।

3. निर्धारण और नाभिक धुंधला

  1. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर, व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (प्रयोगशाला दस्ताने, प्रयोगशाला कोट और सुरक्षा चश्मा सहित) पहने हुए, 0.1% बीएसए इमेजिंग मीडिया में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) तैयार करें।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से क्यूडी-स्पाइक के एस्पिरेट 50 μL और 4% पीएफए के 100 μL / अच्छी तरह से जोड़ें।
    1. कुओं को सूखने न दें। कुओं (अनुशंसित) के सूखने से बचने के लिए एक स्वचालित मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करें।
  3. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. 1x फॉस्फेट-बफ़र्ड नमकीन (पीबीएस) के साथ तीन बार धोएं।
  5. पीबीएस में 1: 1000 कमजोर पड़ने के लिए 5 एमएम स्टॉक समाधान को पतला करके गहरे लाल परमाणु डाई को तैयार करें।
  6. पीबीएस को बाहर निकालें और पतला परमाणु डाई के 50 μL / अच्छी तरह से वापस जोड़ें।
  7. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  9. बाद की तारीख में इमेजिंग के लिए प्लेट सीलर का उपयोग करके प्लेट या सील की छवि बनाएं। प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रतिदीप्ति कई हफ्तों या उससे अधिक के लिए स्थिर होना चाहिए।

4. अधिग्रहण सेट-अप और इमेजिंग

  1. इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म के लिए सॉफ़्टवेयर प्रारंभ करें. उच्च सामग्री इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म चालू करें, और स्थिति पट्टी पर प्रकाश चालू होना चाहिए। यदि मशीन कनेक्ट नहीं है, तो सॉफ्टवेयर ऑफ़लाइन विश्लेषण मोड में चला जाएगा।
  2. इमेजिंग प्लेटफ़ॉर्म में लॉगिन करें.
  3. एक नया अधिग्रहण प्रोटोकॉल बनाएँ।
    1. 96-अच्छी तरह से स्पष्ट नीचे इमेजिंग प्लेट के रूप में प्लेट प्रकार का चयन करें।
      नोट:: उपकरण में प्लेट चयन भिन्न हो सकता है और सही प्लेट परिभाषाओं को लोड करके अनुकूलित किया जा सकता है जिसमें प्लेट आयाम जैसे ऊंचाई, चौड़ाई और अन्य दूरी शामिल हैं ताकि अच्छी तरह से रिक्ति और फोकल पॉइंट्स को परिभाषित किया जा सके।
    2. 40x जल विसर्जन के रूप में confocal और आवर्धन के रूप में ऑप्टिकल मोड का चयन करें।
    3. 1 के रूप में Binning का चयन करें।
    4. 4.3.5-4.3.8 चरणों में वर्णित चैनलों और फ्लोरोसेंट उत्तेजना / उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य चुनें। छवि को देखने और सेटिंग्स उपयुक्त हैं यह सुनिश्चित करने के लिए सेटिंग्स का चयन करते समय एक स्नैपशॉट लें।
      नोट: डिजिटल फेज कंट्रास्ट (डीपीसी) सेल दाग या फ्लोरोसेंट डाई के बिना लाइव कोशिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देगा। यह निश्चित कोशिकाओं के लिए अनुशंसित नहीं है।
    5. अच्छी तरह से परिभाषित सेल निकायों का उत्पादन करने के लिए उच्च कंट्रास्ट जैसे DPC के लिए मोड का चयन करें। यह पुष्टि करने के लिए एक स्नैपशॉट लें कि यह सेटिंग उपयुक्त है, जैसा कि छवि विंडो में देखा गया है.
    6. ACE2-GFP सेल लाइन के साथ उपयोग के लिए FITC चैनल का चयन करें जो सेल के भीतर ACE2 तस्करी के विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है।
    7. QD चैनल के लिए एक कस्टम चैनल बनाने के लिए, चैनल के लिए त्रिभुज ड्रॉप-डाउन मेनू का चयन करें और 405 एनएम रेंज में उत्तेजना और 608 एनएम रेंज में उत्सर्जन चुनें।
    8. यदि कोशिकाओं को तय किया गया था और एक गहरे लाल परमाणु डाई का उपयोग किया गया था, तो सेल बॉडी को और अधिक चित्रित करने और सेल मास्क के रूप में कार्य करने के लिए 630 एनएम से अधिक उत्सर्जन के साथ दूर-लाल चैनल का चयन करें।
    9. एक्सपोज़र समय, लेजर पावर और जेड-ऊंचाई की स्थिति निर्धारित करने के लिए एक मजबूत साइटोप्लाज्मिक क्यूडी सिग्नल के साथ एक अच्छी तरह से चुनें। 4.3.10-4.3.13 से चरणों का पालन करें।
    10. जाँचें कि डिफ़ॉल्ट ऊँचाई एक छवि उत्पन्न करती है जहाँ कक्ष वांछित फोकल प्लेन में होते हैं. यदि एंडोसाइटोसेड पंक्टा लक्ष्य ऑर्गेनेल हैं, तो जेड-स्थिति कम होगी यदि प्लाज्मा झिल्ली लक्ष्य ऑर्गेनेल है।
    11. एक एक्सपोज़र समय चुनें जो पृष्ठभूमि संकेत की तुलना में कम से कम तीन गुना अधिक ग्रे स्तर के साथ एक उज्ज्वल छवि पैदा करता है। यह आमतौर पर 100 और 300 एमएस के बीच होता है। 20 nM पर, ग्रे स्तर लगभग 6000 a.u. होना चाहिए 200 ms के एक जोखिम समय और 80% की लेजर शक्ति का उपयोग कर।
    12. प्रत्येक चैनल में स्नैपशॉट सुविधा के साथ उत्पादित छवि पर राइट-क्लिक करके और तीव्रता दिखाएँ का चयन करके ग्रे स्तरों की जाँच करें. फिर, उस पिक्सेल के लिए ग्रे स्तर देखने के लिए रुचि या पृष्ठभूमि की वस्तु पर बाएँ-क्लिक करें.
    13. ब्याज की वस्तुओं की तीव्रता को ठीक करने के लिए लेजर शक्ति को समायोजित करें।
  4. अधिग्रहण प्रोटोकॉल सहेजें।
  5. प्रयोग चलाएँ पर स्विच करें और प्लेट नाम दर्ज करें.
  6. प्रयोग चलाएं।

5. डेटा विश्लेषण

  1. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर पर डेटा आयात करें.
    1. सभी छवियों को प्राप्त करने के बाद, इमेजिंग सॉफ़्टवेयर को माप निर्यात करें। इसके लिए एक सर्वर स्थापित करने और एक खाता बनाने की आवश्यकता होती है। इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में निर्यात किए जाने वाले डेटा के लिए एक स्क्रीन बनाएँ.
  2. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में, विश्लेषण प्रोटोकॉल का निर्माण शुरू करने के लिए छवि विश्लेषण का चयन करें।
  3. स्क्रीन सूची में फ़ाइल पर राइट-क्लिक करके और चुनें पर क्लिक करके इमेजिंग प्रयोग से माप लोड करें. प्रतिबिंबित कुओं और उनके संबंधित क्षेत्रों का प्लेट मानचित्र खिड़की के निचले बाएं हाथ के कोने में दिखाई देना चाहिए।
  4. छवि विभाजन शुरू करने के लिए उज्ज्वल साइटोप्लाज्मिक क्यूडी स्पॉट के साथ एक अच्छी तरह से चुनें।
  5. इनपुट छवि बिल्डिंग ब्लॉक में, Flatfield सुधार का चयन करें।
  6. ढूँढें नाभिक का चयन करके प्रोटोकॉल में अगले बिल्डिंग ब्लॉक जोड़ें।
    1. यहां, नाभिक मार्कर के रूप में डीपीसी या दूर-लाल चैनल का उपयोग करें।
    2. उस विधि का चयन करें जो पहले ऑब्जेक्ट्स को सटीक रूप से विभाजित करती है, और फिर ड्रॉप-डाउन मेनू का उपयोग करके विभाजन को ठीक-ट्यून करती है और स्लाइडर को समायोजित करती है।
      नोट: अच्छा विभाजन नाभिक, सेल और धब्बों के लिए ब्याज के क्षेत्र (ROI) को सटीक रूप से परिभाषित करता है। केवल पिक्सेल जो मार्कर के लिए सकारात्मक हैं, उन्हें एक व्यक्तिगत ROI के भीतर कैप्चर किया जाना चाहिए। पृष्ठभूमि संकेत को बाहर रखा जाना चाहिए। यदि पृष्ठभूमि को ROI में कैप्चर किया गया है, तो विधि की संवेदनशीलता को कम किया जा सकता है, या विभाजन एल्गोरिथ्म की स्ट्रिंगेंसी को बढ़ाने के लिए तीव्रता की दहलीज को बढ़ाया जा सकता है। यह सभी ढूँढें बिल्डिंग ब्लॉकों पर लागू होता है.
  7. अगला, साइटोप्लाज्म की पहचान करने के लिए साइटोप्लाज्म बिल्डिंग ब्लॉक ढूंढें जोड़ें।
    1. इस मामले में, साइटोप्लाज्मिक विभाजन के लिए ACE2-GFP चैनल का उपयोग करें।
    2. उस विधि का चयन करें जो प्रत्येक कोशिका के साइटोप्लाज्म की सबसे अच्छी तरह से पहचान करती है।
  8. अगला, QD-स्पाइक puncta की पहचान करने के लिए स्पॉट ्स बिल्डिंग ब्लॉक ढूँढें जोड़ें।
    1. ROI जनसंख्या के रूप में नाभिक का चयन करें।
    2. ROI क्षेत्र के रूप में कक्ष का चयन करें। यह पूरे सेल के भीतर puncta कैप्चर करता है।
    3. उस विधि का चयन करें जो प्रत्येक कक्ष में QD puncta की सबसे अच्छी पहचान करती है.
  9. एक बार जब छवि में सभी वस्तुओं को विभाजित किया गया है और इस अच्छी तरह से सटीक रूप से पहचाना गया है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए अन्य कुओं का चयन करें कि बिल्डिंग ब्लॉक और सेटिंग्स को आम तौर पर अन्य कुओं और अन्य स्थितियों पर लागू किया जा सकता है।
  10. सभी खंडित ऑब्जेक्ट्स (नाभिक, साइटोप्लाज्म/कोशिकाओं, और धब्बे) के लिए तीव्रता गुण परिकलित करें जोड़ें.
  11. सभी खंडित वस्तुओं (नाभिक, साइटोप्लाज्म/ कोशिकाओं, और धब्बे) के लिए आकृति विज्ञान गुणों की गणना करें जोड़ें।
  12. सभी खंडित ऑब्जेक्ट्स (नाभिक, साइटोप्लाज्म/कोशिकाओं, और धब्बे) के लिए बनावट गुणों की गणना करें जोड़ें.
  13. नाभिक और धब्बों सहित प्रत्येक जनसंख्या के लिए मापदंडों का चयन करके परिणामों को परिभाषित करें। वस्तुओं की संख्या का उपयोग सेल व्यवहार्यता के अप्रत्यक्ष माप के रूप में किया जा सकता है।

6. निर्यात डेटा

  1. Batch analysis पर क्लिक करें। अगले चरण (चरण 6.2) पर आगे बढ़ने से पहले विश्लेषण समाप्त होने की प्रतीक्षा करें।
    नोट:: बैच विश्लेषण छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर सर्वर डेटा दूरस्थ रूप से विश्लेषण करने के लिए चयनित माप का उपयोग कर विश्लेषण प्रोटोकॉल लोड करने के लिए अनुमति देता है।
  2. डेटासेट को स्थानीय कंप्यूटर या नेटवर्क ड्राइव पर निर्यात करें.
    1. छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर को कंप्यूटर पर किसी सहायक अनुप्रयोग से कनेक्शन फ़ाइल डाउनलोड और खोलकर कनेक्ट करें.
    2. परिणाम फ़ाइल प्रकार (.txt, .csv, .html, या मूल XML) का चयन करें.
    3. ड्रॉप-डाउन मेनू के साथ फ़ाइल फ़ोल्डर सेटिंग्स चुनें.

7. एक स्प्रेडशीट में डेटा का विश्लेषण

  1. निर्यात की गई फ़ाइल खोलें. यदि यह एक .csv फ़ाइल है, तो इसे पिवट तालिकाओं के उपयोग को सक्षम करने के लिए .xls फ़ाइल स्वरूप के रूप में सहेजें. यदि फ़ाइल पथ बहुत लंबा है, तो सहेजने में त्रुटियों से बचने के लिए फ़ोल्डर पदानुक्रम में उच्च .xls फ़ाइल सहेजें।
  2. स्प्रेडशीट में स्तंभ जोड़ें जो प्रत्येक अच्छी तरह से शर्तों को निर्दिष्ट करते हैं। उदाहरण के लिए, सेल प्रकार, QD-स्पाइक वेरिएंट, QD-स्पाइक सांद्रता, इनक्यूबेशन समय, आदि।
  3. Pivot Table फ़ंक्शन चुनें और पंक्तियों के रूप में जोड़ी गई शर्तों और मापे गए पैरामीटर्स को स्तंभों के रूप में उपयोग करके तालिका बनाएँ. प्रत्येक पैरामीटर के लिए परिकलन का चयन करें अर्थात, औसत, मानक विचलन, माध्यिका, न्यूनतम, अधिकतम, या गणना.
  4. नमूनों को नियंत्रित करने के लिए डेटा को सामान्य करें, जिसमें 0% के रूप में असंगत QDs और QD-स्पाइक की उच्चतम सांद्रता 100% के रूप में शामिल है।
    नोट: यदि एंटीबॉडी को बेअसर करने जैसे अवरोधकों की प्रभावकारिता का आकलन करते हैं, तो डेटा को केवल मीडिया-केवल उपचारित कोशिकाओं (100% प्रभावकारिता) और क्यूडी-स्पाइक को अवरोधक (0% प्रभावकारिता) के बिना सामान्य करें।
  5. ग्राफिंग सॉफ़्टवेयर में डेटा प्लॉट करें.

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Representative Results

उपचार पर, क्यूडी को आंतरिक रूप से बदल दिया जाएगा क्योंकि नैनोपार्टिकल प्लाज्मा झिल्ली पर एसीई 2 से बंधेगा और एंडोसाइटोसिस को प्रेरित करेगा। सेल लाइन को व्यक्त करने वाले एसीई 2-जीएफपी का उपयोग करके, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके क्यूडी और एसीई 2 दोनों के स्थानांतरण की कल्पना की जा सकती है। एक बार आंतरिक होने के बाद, दो QD और ACE2 सिग्नल मजबूत colocalization दिखाते हैं। इन छवियों से, छवि विभाजन और बाद के विश्लेषण को स्पॉट काउंट (चित्रा 1, चित्रा 2 बी) जैसे प्रासंगिक मापदंडों को निकालने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 1A कोशिकाओं का एक असेंबल है जिसे क्यूडी-स्पाइक या मीडिया की विभिन्न सांद्रता के साथ केवल नियंत्रण के रूप में इलाज किया जाता है। तीन चैनलों का उपयोग किया गया था, जिसमें डिजिटल फेज कंट्रास्ट, एफआईटीसी, और 405 एनएम पर उत्तेजना और 608 एनएम पर उत्सर्जन के साथ कस्टम क्यूडी चैनल शामिल थे। DPC सामान्य सेल आकार की एक छवि प्रदान करता है। डीपीसी छवि पूरे सेल आकृति विज्ञान का अनुमानित संकेत प्रदान करती है। ब्याज का क्षेत्र DPC संकेत के साथ ओवरलैप करता है और आंतरिक QDs का पता लगाने के लिए पर्याप्त है। FITC चैनल ACE2-GFP स्थानीयकरण बदलने और QD-स्पाइक के साथ colocalize क्षेत्रों में जमा दिखाता है। जैसा कि क्यूडी-स्पाइक की एकाग्रता कम हो जाती है, क्यूडी अब दिखाई नहीं देते हैं और एसीई 2-जीएफपी सिग्नल नियंत्रण के समान है। मर्ज चैनल QD-स्पाइक के साथ ACE2-GFP के सह-स्थानीयकरण को प्रदर्शित करता है। ये वस्तुएं धब्बों और बड़े संचयों का मिश्रण हैं जिन्हें विश्लेषण सॉफ़्टवेयर के साथ विभाजित किया जा सकता है। छवि विभाजन के लिए उपयोग की जाने वाली सॉफ़्टवेयर विश्लेषण विधि की फाइन-ट्यूनिंग का उपयोग ब्याज की वस्तुओं को विभाजित करने के लिए किया जा सकता है।

यहां क्यूडी-स्पाइक के छह अलग-अलग सांद्रता के साथ एक एकाग्रता-प्रतिक्रिया प्रयोग किया गया था, जो क्यूडी (चित्रा 2 ए) की इष्टतम सांद्रता निर्धारित करने के लिए 20 एनएम से शुरू हुआ था। QDs का उपयोग 2.22 nM के रूप में कम किया जा सकता है और अभी भी बाध्यकारी और आंतरिककरण दिखाता है। हालांकि, एक मजबूत प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए 20 एनएम या उससे अधिक की सांद्रता का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।

क्यूडी के संयुग्मन के दौरान, प्रोटीन एकत्रीकरण हो सकता है। समुच्चय के साथ मुख्य मुद्दा यह है कि वे कोशिकाओं के शीर्ष पर जमा हो जाएंगे और छवि विभाजन चरण में कलाकृतियों का कारण बनेंगे। समुच्चय कोशिकाओं में प्रवेश करने में सक्षम नहीं होंगे, और एक पूरे के रूप में नैनोकणअब वायरल कण (चित्रा 3) के समान नहीं होंगे। समुच्चय को क्यूडी समाधान में उज्ज्वल, clumped अवक्षेप के रूप में देखा जा सकता है।

इस परख का उपयोग जीवविज्ञान का आकलन करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि एंटीबॉडी को बेअसर करना जो वायरल प्रविष्टि को अवरुद्ध करते हैं। क्यूडी को बेअसर करने वाले एंटीबॉडी (चित्रा 4 ए) के साथ इनक्यूबेट किया गया था, जो कोशिकाओं के अलावा कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 30 μg / mL से शुरू होता है। संदर्भ वाशिंगटन स्ट्रेन, सार्स-कोव -2 आरबीडी के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था। उन्होंने बाध्यकारी, आंतरिककरण को अवरुद्ध कर दिया, और क्यूडी-केवल (चित्रा 4 बी) के साथ इलाज की गई कोशिकाओं की तुलना में मापा स्पॉट काउंट में कमी का कारण बना।

Figure 1
चित्रा 1: उच्च सामग्री छवि विश्लेषण और ACE2-GFP कोशिकाओं के विभाजन QD608-स्पाइक के साथ इलाज किया. सटीक विभाजन की प्रतिनिधि छवियां। सबसे पहले, नाभिक को आरओआई आबादी बनाने के लिए परमाणु मार्कर वाले चैनल से विभाजित किया जाता है। ROI जनसंख्या से, सेल को रेखांकित करने वाला एक ROI क्षेत्र ACE2-GFP चैनल का उपयोग करके विभाजित किया जाता है। अंत में, QD608-स्पाइक स्पॉट सेल ROI क्षेत्र से विभाजित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: QD608-स्पाइक hACE2 को बांधता है और hACE2-GFP HEK293T कोशिकाओं में एंडोसाइटोसेड होता है। (A) hACE2-GFP (पीला) HEK293T कोशिकाओं की छवि असेंबल QD608-स्पाइक (मैजेंटा) या केवल मीडिया की कई सांद्रता के साथ इलाज किया जाता है। डिजिटल फेज कंट्रास्ट (सियान) का उपयोग सेल बॉडी की कल्पना करने के लिए किया गया था। स्केल बार: 20 μm. (B) QD608-स्पाइक स्पॉट काउंट्स का उच्च सामग्री विश्लेषण 20 nM QD608-स्पाइक (100%) और नियंत्रण (0%) के लिए सामान्यीकृत है। N = तीन गुना कुएँ। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन (S.D.) को इंगित करती हैं. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एकत्रित QD608-स्पाइक hACE2-GFP HEK293T कक्षों में आंतरिक नहीं है। hACE2-GFP HEK293T कोशिकाओं की छवि असेंबल 10 nM QD608-स्पाइक या मीडिया-केवल के साथ इलाज किया। स्केल बार: 20 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: न्यूट्रलाइज़िंग एंटीबॉडी hACE2-GFP HEK293T कोशिकाओं में QD608-स्पाइक के एंडोसाइटोसिस को अवरुद्ध करता है। (A) HACE2-GFP (पीला) HEK293T कोशिकाओं की छवि असेंबल QD608-स्पाइक (मैजेंटा) के साथ इलाज किया जाता है, जो कोशिका निकायों की पहचान करने के लिए डिजिटल फेज कंट्रास्ट (सियान) का उपयोग करके बेअसर एंटीबॉडी की घटती सांद्रता के साथ पहले से ही ऊष्मायन किया जाता है। स्केल बार: 20 μm. (B) QD608-स्पाइक स्पॉट काउंट्स का उच्च सामग्री विश्लेषण केवल मीडिया-केवल नियंत्रण (100%) और 10 nM QD608-स्पाइक केवल (0%) के लिए सामान्यीकृत है। N = तीन गुना कुएँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस आलेख में वर्णित विधि उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके मानव कोशिकाओं में कार्यात्मक क्यूडी इमेजिंग के लिए आवश्यक चरण प्रदान करती है। यह विधि उन कोशिकाओं के लिए सबसे उपयुक्त है जहां एंडोसाइटोसिस टीएमपीआरएसएस 2 और झिल्ली संलयन की गतिविधि के बजाय वायरल प्रवेश का मुख्य मार्ग है, क्योंकि यह सार्स-कोव -2 स्पाइक और एचएसीई 2 एंडोसाइटोसिस के अध्ययन को सक्षम बनाता है। क्यूडी मॉडल की प्रकृति और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्पाइक ट्रिमर पर सी-टर्मिनल हिस-टैग के कारण, स्पाइक एस 1 और एस 2 डोमेन के किसी भी TMPRSS2 दरार ने QD को केवल S2 डोमेन से जुड़ा हुआ छोड़ दिया होगा। यह आंतरिककरण को रोक सकता है, यह देखते हुए कि आरबीडी एस 1 में पाया जाता है। इसलिए, यदि सेल की सतह पर घटनाओं का अनुक्रम सटीक था, जहां hACE2 बाध्य है और फिर TMPRSS2 स्पाइक को क्लीव करता है, तो कोई आंतरिककरण के साथ एक नकारात्मक संकेत की उम्मीद नहीं है।

जैसा कि यह प्रोटोकॉल इमेजिंग सेलुलर प्रक्रियाओं से संबंधित है, सुसंस्कृत कोशिकाओं को एचएसीई 2 की अभिव्यक्ति के साथ वायरल संक्रमण के लिए अनुमोदित होना चाहिए। hACE2 कोशिकाओं में क्षणिक रूप से transfected हो सकता है, या hACE2 को व्यक्त करने वाली एक स्थिर सेल लाइन उत्पन्न हो सकती है17। HACE2 अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण को सत्यापित करने की सिफारिश की जाती है, जब तक कि hACE2 में GFP जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग न हो, जिसे माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा जा सकता है। GFP-टैग hACE2 QD-स्पाइक एंडोसाइटोसिस के बाद hACE2 तस्करी visualizing के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है। अंतर्जात hACE2 अभिव्यक्ति के साथ कुछ सेल लाइनों का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह immunocytochemistry का उपयोग करके पुष्टि की जानी चाहिए। कुछ मामलों में, अंतर्जात अभिव्यक्ति QD-स्पाइक के लिए पर्याप्त hACE2 बाध्यकारी भागीदार प्रदान नहीं करती है और इसके परिणामस्वरूप एक संकेत हो सकता है जो उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा खराब रूप से पता लगाया जाता है।

प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम में उच्च गुणवत्ता वाले क्यूडी की खरीद शामिल है जो पुनः संयोजक उनके-टैग किए गए सार्स-कोव-2 स्पाइक के लिए संयुग्मित है। इसके लिए शर्त एक ठीक से शुद्ध प्रोटीन है जिसे एकत्रीकरण के कारण के बिना क्यूडी में संयुग्मित किया जा सकता है। समेकित QDs में कई समस्याएं होंगी जो एक सफल प्रयोग को रोकती हैं। इसलिए, पूर्ण प्रयोग से पहले विश्लेषण उपकरणों (जैसे, यूवी-दृश्यमान स्पेक्ट्रोस्कोपी, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, या गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन) का उपयोग करके क्यूडी-स्पाइक का परीक्षण मूल्यवान अभिकर्मकों का परीक्षण करने से पहले मूल्यवान संसाधनों को संरक्षित करने के लिए अत्यधिक अनुशंसित है। स्पाइक के साथ क्यूडी के लेबलिंग के दौरान, क्यूडी और स्पाइक की विशिष्ट सांद्रता को अणुओं के एक विशिष्ट अनुपात को प्राप्त करने के लिए मिश्रित किया जाता है। केवल क्यूडी और स्पाइक मिश्रित हैं, और दोनों समाधान अत्यधिक शुद्ध हैं। क्यूडी के लेबलिंग का आकलन करने के लिए, एक एक्रिलामाइड जेल को अकेले क्यूडी के साथ-साथ क्यूडी-संयुग्मित स्पाइक के साथ डाला और लोड किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप भारी आणविक भार बैंड होते हैं।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले क्यूडी में यूवी उत्तेजना (≤405 एनएम) के बाद 608 एनएम उत्सर्जन के लिए एक प्रतिदीप्ति उत्तेजना / उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ट्यून किया गया है क्योंकि अधिकांश क्यूडी में यूवी रेंज के पास उच्च अवशोषण होता है जो उच्च फोटोल्यूमिनेसेंस 18 का उत्पादन करता है। यह एक अपरंपरागत उत्तेजना / उत्सर्जन संयोजन है जिसके लिए अनुकूलन योग्य चैनलों के लिए माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है। कई पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोप सही फिल्टर और लेजर लाइनों के साथ स्थापित किया जा सकता है इस उत्तेजना / उत्सर्जन को प्राप्त करने के लिए। वैकल्पिक रूप से, पहले अवशोषण अधिकतम पर क्यूडी की उत्तेजना, उत्सर्जन शिखर से लगभग 10 से 20 एनएम दूर (उदाहरण के लिए, यहां उपयोग किए जाने वाले क्यूडी 608 के लिए 592 एनएम), पर्याप्त फोटोल्यूमिनेसेंस का उत्पादन करने में भी सक्षम होगी।

इस उच्च-सामग्री विश्लेषण प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले क्लाउड-आधारित सॉफ़्टवेयर एक नामकरण योजना का उपयोग करता है जो पिछले चरणों पर बनाता है। उदाहरण के लिए, पहली वस्तुएं जो खंडित होती हैं, वे नाभिक होती हैं, जो नाभिक नामक आबादी का निर्माण करती हैं। इसके बाद, सेल या साइटोप्लाज्म को जनसंख्या नाभिक के भीतर एक आरओआई क्षेत्र के रूप में पहचाना जा सकता है। छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में उपयोग की जाने वाली शब्दावली नाभिक बिल्डिंग ब्लॉक का उपयोग करके विभाजित वस्तुओं की आबादी का नाम नाभिक के रूप में निर्धारित करती है। हालांकि, उन्हें आवश्यक रूप से नाभिक नहीं होना चाहिए और यदि कोई परमाणु डाई उपलब्ध नहीं है तो सेल निकाय हो सकते हैं। इस नामकरण योजना को प्रत्येक बिल्डिंग ब्लॉक आउटपुट नाम के भीतर भी बदला और अनुकूलित किया जा सकता है।

हमारे प्रोटोकॉल झिल्ली इंटरैक्शन के लिए खाता नहीं था, लेकिन यह एक अतिरिक्त झिल्ली दाग जोड़कर किया जा सकता है जो एसीई 2-जीएफपी तस्करी से स्वतंत्र है। Nonspecific बाध्यकारी ब्लॉक करने के लिए, 0.1% BSA परख मीडिया (DMEM + 0.1% BSA) में शामिल है, और कोशिकाओं को 10% FBS में भी उगाया जाता है। उत्परिवर्ती स्पाइक प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्पाइक प्रोटीन तक सीमित थे। इस मामले में, एक सार्स-कोव -2 उत्परिवर्ती गैर-एसीई 2 बाध्यकारी स्पाइक प्रोटीन उपलब्ध नहीं था।

क्यूडी नैनोपार्टिकल विधि स्पाइक-मध्यस्थता प्रविष्टि पर भरोसा करने वाले वायरस के बंधन और आंतरिककरण का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक प्रस्तुत करती है। इस परख एक अनुरूप तरीके से उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, repurpose और शक्तिशाली antivirals कि सेलुलर प्रविष्टि ब्लॉक की पहचान करने के लिए. हालांकि इस प्रोटोकॉल ने केवल सार्स-कोव -2 के वाशिंगटन डब्ल्यूए -1 संदर्भ तनाव के लिए संयुग्मित क्यूडी के उपयोग का प्रदर्शन किया, इस परख को आसानी से नए उभरते वेरिएंट जैसे अल्फा, बीटा, गामा और डेल्टा के बाध्यकारी गुणों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जो क्यूडी के लिए संयुग्मित उनके संबंधित स्पाइक प्रोटीन के उपयोग के माध्यम से है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को नेशनल सेंटर फॉर एडवांसिंग ट्रांसलेशनल साइंसेज, एनआईएच के इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। नौसेना अनुसंधान प्रयोगशाला ने अपने आंतरिक नैनोसाइंस इंस्टीट्यूट के माध्यम से धन प्रदान किया। एनआरएल कोविड-19 बेस फंड के माध्यम से अभिकर्मक तैयारी का समर्थन किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
32% Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714 Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2%
Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1%
7.5% Bovine Serum Albumin Gibco 15260-037 Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting
Acridine Orange / Propidium Iodide Stain Logos Biosystems F23001 Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike
Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine Greiner 655946 Used to support cell culture, DMEM supplement
Characterized Fetal Bovine Serum Cytiva/HyClone SH30071.03 Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1
Columbus Analyzer Perkin Elmer NA Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye
DRAQ5 (5 mM) ThermoFisher Scientific 62252 Basal media for HEK293T cell culture
Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red Gibco 11995-065 Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365
Excel Microsoft NA Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement
G418 InvivoGen ant-gn-5 Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP
HEK293T hACE2-GFP Codex Biosolutions CB-97100-203 Automated cell counter
Luna Automated Cell Counter Logos Biosystems NA Used for fluorescence cell counting
Luna Cell Counting Slides Logos Biosystems L12001 High-content imaging platform
Opera Phenix Perkin Elmer NA Imaging media, used for incubating cells with quantum dots
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 11058-021 Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying
PBS -/- Gibco 10010-023 Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122 Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0
Prism GraphPad NA Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis
Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) custom made by Naval Research Laboratory Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab Sino Biological 40592-MM57 Used to dissociate cells from flask during passaging
TrypLE Express Gibco 12605-010

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References

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जीव विज्ञान अंक 182
क्वांटम डॉट-संयुग्मित SARS-CoV-2 स्पाइक ट्रिमर्स के उच्च-थ्रूपुट कॉन्फोकल इमेजिंग HEK293T कोशिकाओं में बाइंडिंग और एंडोसाइटोसिस को ट्रैक करने के लिए
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