量子点偶联SARS-CoV-2穗状三聚体的高通量共聚焦成像，以追踪HEK293T细胞中的结合和内吞作用
Summary
在该协议中，与重组SARS-CoV-2尖峰偶联的量子点使基于细胞的测定能够监测质膜上与hACE2的尖峰结合以及随后结合蛋白进入细胞质的内吞作用。
Abstract
细胞荧光显微镜新技术的发展促进了药物发现的高通量筛选方法。量子点是荧光纳米粒子，具有优异的光物理特性，具有明亮稳定的光致发光以及窄发射带。量子点呈球形，通过对表面化学的适当修饰，可用于共轭生物分子用于细胞应用。这些光学特性，加上用生物分子使它们功能化的能力，使它们成为研究受体 – 配体相互作用和细胞运输的绝佳工具。在这里，我们提出了一种使用量子点来跟踪SARS-CoV-2刺突蛋白的结合和内吞作用的方法。该协议可以用作实验者的指南，这些实验者希望利用量子点在细胞生理学的背景下研究蛋白质 – 蛋白质相互作用和运输。
Introduction
荧光显微镜使研究人员能够使用专门的染料1，遗传编码的荧光蛋白2和量子点（QDs）形式的荧光纳米颗粒3来观察细胞的内部运作。对于2019年严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）全球大流行，研究人员利用荧光显微镜来了解病毒如何在质膜和细胞质中与细胞相互作用。例如，研究人员已经能够深入了解病毒体表面的SARS-CoV-2 Spike蛋白与人类细胞表面的人血管紧张素转换酶2（hACE2）的结合，随后 通过 质膜融合的内化以及Spike：hACE2蛋白复合物的内吞作用4，5。使用细胞荧光成像对SARS-CoV-2 通过 溶酶体从细胞中流出也有很好的见解，这是冠状病毒的一个独特特征，以前被认为是 通过 高尔基体的传统囊泡萌芽发生的，就像许多其他病毒一样6。作为生物学研究几乎所有方面的支柱，细胞荧光显微镜技术在其应用的广度和范围上必然得到发展，从整个动物的超分辨率成像到用于药物筛选的自动高内涵多参数成像。在这里，自动高内涵共聚焦显微镜应用于使用与病毒刺突蛋白偶联的荧光量子点研究SARS-CoV-2细胞进入。
对生物成像平台生成的图像进行高内涵分析，可以比使用多模态读板器获得的全孔强度等单个参数更好地提取有价值的生物学见解7。通过使用自动分割算法分离视野中的物体，可以分析每个物体或一组物体，以查找每个可用荧光通道中的强度、面积和纹理等参数8。将许多测量值组合到多变量数据集中是表型分析的有用方法。当已知所需的表型时，例如Puncta形式的QD内化，可以使用与puncta相关的测量值（例如大小，数量和强度）来评估治疗的疗效。
基于云的高内涵成像分析软件可以容纳各种仪器数据输出，包括高内涵成像平台。通过使用基于云的服务器进行图像存储和在线分析，用户能够从成像仪器或存储数据的网络驱动器上传数据。该协议的分析部分在云软件环境中进行，数据可以以各种文件格式导出，用于下游数据可视化。
SARS-CoV-2病毒由非结构和结构蛋白组成，有助于其组装和复制。SARS-CoV-2尖峰具有两个称为S1和S2的结构域，其中S1包含负责质膜上hACE2相互作用的受体结合结构域9。Spike还被发现与质膜上的其他分子相互作用，这些分子除了hACE210，11之外可能还充当共受体。在整个刺突蛋白序列中，特别是在S1 / S2界面处，存在蛋白酶切割位点，可以在跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）12之后的膜上融合。从单个受体结合域到S1，S2，S1和S2以及来自多个商业供应商的全穗三聚体，已经生产出各种重组SARS-CoV-2 Spike蛋白，用于研究活动13。
在这项工作中，量子点的表面被含有组氨酸标签（QD-Spike）的重组尖刺三聚体功能化。海军研究实验室光学纳米材料科生产的量子点含有硒化镉芯和硫化锌壳14，15。QD表面上的锌协调重组蛋白内的组氨酸残基，形成功能化的QD，其形式和功能类似于SARS-CoV-2病毒颗粒。纳米颗粒和蛋白质偶联的产生之前使用QD偶联受体结合域15进行了描述。该方法描述了细胞培养制剂，QD治疗，图像采集和数据分析方案，可以指导研究人员在人类细胞的生理环境中研究SARS-CoV-2 Spike活性。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文中描述的方法为使用高通量共聚焦显微镜对人细胞中的功能化量子点进行成像提供了必要的步骤。该方法最适合于内吞作用是病毒进入的主要途径而不是TMPRSS2和膜融合的活性的细胞，因为它可以研究SARS-CoV-2 Spike和hACE2内吞作用。由于QD模型的性质和市售Spike三聚体上的C端His-tag，Spike S1和S2结构域的任何TMPRSS2切割都将使QD仅附着在S2结构域12上。这可能会阻止内部化，因为 RBD ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了美国国立卫生研究院国家转化科学促进中心校内研究计划的部分支持。海军研究实验室 通过其 内部纳米科学研究所提供资金。试剂制备 通过 NRL COVID-19基础基金得到支持。
Materials
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | Used for fixing cells after quantum dot treatment, final concentration 3.2% Used for stabilizing QDs in Optimem I and preventing non-specific interactions, final concentration 0.1% |
| 7.5% Bovine Serum Albumin | Gibco | 15260-037 | Used as a cell viability dye for fluorescence cell counting |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Microwell plates used for seeding cells and assaying QD-Spike |
| Black clear bottom 96 well coated plate coated with poly-D-lysine | Greiner | 655946 | Used to support cell culture, DMEM supplement |
| Characterized Fetal Bovine Serum | Cytiva/HyClone | SH30071.03 | Cloud-based high-content image analysis software; V2.9.1 |
| Columbus Analyzer | Perkin Elmer | NA | Used for labeling cell nuclei and cell bodies after fixation, deep red nuclear dye |
| DRAQ5 (5 mM) | ThermoFisher Scientific | 62252 | Basal media for HEK293T cell culture |
| Dulbecco's Minimal Essential Media, D-glucose (4.5g/L), L-glutamine, sodium pyruvate (110 mg/L), phenol red | Gibco | 11995-065 | Used for arranging data after export from Columbus; V2110 Microsoft 365 |
| Excel | Microsoft | NA | Used to continue selection of hACE2-GFP positive cells, DMEM supplement |
| G418 | InvivoGen | ant-gn-5 | Human embryonic kidney cell line stably expression human angiotensin converting enzyme 2 tagged with GFP |
| HEK293T hACE2-GFP | Codex Biosolutions | CB-97100-203 | Automated cell counter |
| Luna Automated Cell Counter | Logos Biosystems | NA | Used for fluorescence cell counting |
| Luna Cell Counting Slides | Logos Biosystems | L12001 | High-content imaging platform |
| Opera Phenix | Perkin Elmer | NA | Imaging media, used for incubating cells with quantum dots |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058-021 | Phosphate-buffered saline without calcium or magnesium used for washing cells during passaging and assaying |
| PBS -/- | Gibco | 10010-023 | Used to prevent bacterial contamination of cell culture, DMEM supplement |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Used for graphing, data visualization, and statistical analysis;V9.1.0 |
| Prism | GraphPad | NA | Used for assaying SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 and monitoring Spike endocytosis |
| Quantum Dot 608 nm-Spike (QD608-Spike) | custom made by Naval Research Laboratory | Used for inhibition of SARS-Cov-2 Spike binding to hACE2 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | Sino Biological | 40592-MM57 | Used to dissociate cells from flask during passaging |
| TrypLE Express | Gibco | 12605-010 |
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