इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए वयस्क, किशोर, लार्वा और भ्रूण ज़ेब्राफिश से कार्डियक और संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं का अलगाव
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल वयस्क, किशोर, लार्वा, और भ्रूण ज़ेब्राफिश (डेनियो रेरियो) से व्यवहार्य हृदय और संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के तीव्र अलगाव का वर्णन करता है, जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए उपयुक्त है।
Abstract
जेब्राफिश का उपयोग लंबे समय से कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान में एक मॉडल कशेरुक जीव के रूप में किया जाता है। जेब्राफिश कार्डियोवैस्कुलर ऊतकों से व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करने की तकनीकी कठिनाइयां उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अध्ययन करने में सीमित रही हैं। जेब्राफिश दिलों के विच्छेदन और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स के अलगाव के लिए पिछले तरीकों का वर्णन किया गया है। हालांकि, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए ज़ेब्राफिश एट्रियल और संवहनी मायोसाइट्स का अलगाव विस्तृत नहीं था। यह काम नए और संशोधित एंजाइमेटिक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो नियमित रूप से पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए उपयुक्त बल्बनुमा धमनी से पृथक किशोर और वयस्क जेब्राफिश वेंट्रिकुलर और एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स, साथ ही संवहनी चिकनी मांसपेशी (वीएसएम) कोशिकाओं को प्रदान करते हैं। विकास के भ्रूण और लार्वा चरणों में पृथक ज़ेब्राफिश कार्डियोवैस्कुलर ऊतकों पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन का कोई साहित्यिक प्रमाण नहीं मिला है। आंशिक पृथक्करण तकनीक जो लार्वा और भ्रूण के दिल से व्यक्तिगत कोशिकाओं पर पैच-क्लैंप प्रयोगों की अनुमति देती है, का प्रदर्शन किया जाता है।
Introduction
ज़ेब्राफिश छोटी टेलीओस्ट मछली हैं जिन्हें लंबे समय से एक मॉडल कशेरुक जीव1 के रूप में उपयोग किया जाता है और हाल ही में जीन और ड्रग्स 2,3 की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक व्यवहार्य कशेरुक प्रणाली के रूप में प्रमुखता से आया है। हालांकि, जेब्राफिश ऊतकों का शारीरिक विश्लेषण अच्छी तरह से विकसित नहीं हुआ है। कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम में, जेब्राफिश दिल4 के विच्छेदन और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स 5,6,7 के अलगाव के लिए तरीकों का वर्णन किया गया है। एट्रियल मायोसाइट्स के प्रभावी अलगाव के कुछ विस्तृत विवरण हैं और पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए संवहनी चिकनी मांसपेशियों (वीएसएम) की तैयारी की कोई रिपोर्ट नहीं है।
वर्तमान कार्य जेब्राफिश कार्डियक और संवहनी मायोसाइट्स के अलगाव के लिए पद्धति का वर्णन करता है, जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और कार्यात्मक अध्ययनों के लिए व्यवहार्य है। इस दृष्टिकोण में जेब्राफिश वेंट्रिकुलर मायोसाइट अलगाव 5,6 के लिए पहले से रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉलके संशोधन शामिल हैं और स्तनधारी वीएसएम सेल अलगाव8 से तरीकों को अनुकूलित करता है, जिससे बल्बनुमा धमनी (बीए) से ज़ेब्राफिश संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति मिलती है। प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप जेब्राफिश से पृथक आलिंद, वेंट्रिकुलर और वीएसएम कोशिकाओं की कुशल पैदावार होती है जिसे 8 घंटे9 तक पैच-क्लैंप अध्ययन में मज़बूती से उपयोग किया जा सकता है।
उनके लगभग पारदर्शी लार्वा के बावजूद जो माता-पिता के जीव के बाहर पूरी तरह से विकसित होते हैं, कार्डियोवैस्कुलर विकास का अध्ययन करने में उनकी वादा की गई ऑन्टोजेनेटिक क्षमता की खोज कम उम्र में ऊतकों को निकालने और विश्लेषण करने में चुनौतियों से सीमित हो गई है। वर्तमान लेख एक अनुकूलित, प्रकाशित निष्कर्षण विधि 10 का उपयोग करके 3 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) के रूप में पृथक ज़ेब्राफिश दिलों पर पैच-क्लैंपप्रयोगों का प्रदर्शन करके इस सीमा को संबोधित करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ज़ेब्राफिश वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स 5,6 को अलग करने के लिए पिछले तरीके, जिसका उद्देश्य संस्कृति या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों के लिए मायोसाइट्स उत्पन्न करना है, ने कम उपज की क…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को एनआईएच द्वारा सीजीएन को एचएल 140024 और सीएमसी को एचएल 150277 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 1 और चित्रा 2 BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
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