전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리
Summary
본 프로토콜은 전기생리학적 연구에 적합한 성체, 청소년, 유충 및 배아 제브라피쉬(Danio rerio)로부터 생존가능한 심장 및 혈관 평활근 세포의 급성 단리를 기술한다.
Abstract
제브라피쉬는 오랫동안 심혈관 연구에서 모델 척추동물 유기체로 사용되어 왔습니다. 제브라 피쉬 심혈관 조직에서 개별 세포를 분리하는 기술적 어려움은 전기 생리 학적 특성을 연구하는 데 제한적이었습니다. 이전의 방법은 제브라 피쉬 심장의 해부와 심실 심장 근육 세포의 분리에 대해 설명되었습니다. 그러나, 전기 생리 학적 특성화를위한 제브라 피쉬 심방 및 혈관 근육 세포의 분리는 상세하지 않았다. 이 연구는 패치 클램프 실험에 적합한 구근 동맥의 혈관 평활근 (VSM) 세포뿐만 아니라 분리 된 청소년 및 성인 제브라 피쉬 심실 및 심방 심근 세포를 일상적으로 제공하는 새롭고 수정 된 효소 프로토콜을 설명합니다. 배아 및 애벌레 발달 단계에서 분리 된 제브라 피쉬 심혈관 조직에 대한 전기 생리 학적 연구에 대한 문헌적 증거는 없습니다. 유충 및 배아 심장의 개별 세포에 대한 패치 클램프 실험을 허용하는 부분 해리 기술이 시연됩니다.
Introduction
제브라피쉬는 오랫동안 모델 척추동물 유기체1로 사용되어 왔으며 최근에는 유전자 및 약물 2,3의 고처리량 스크리닝을 위한 실행 가능한 척추동물 시스템으로 두각을 나타내고 있는 작은 텔레오스트 물고기입니다. 그러나 제브라 피쉬 조직의 생리 학적 분석은 잘 발달되어 있지 않습니다. 심장 혈관계에서 제브라 피쉬 심장4의 해부와 심실 심장 근육 세포의 분리 5,6,7에 대한 방법이 설명되었습니다. 심방 근육 세포의 효과적인 분리에 대한 자세한 설명은 거의 없으며 패치 클램프 연구를위한 혈관 평활근 (VSM) 준비에 대한보고는 없습니다.
현재의 연구는 전기 생리 학적 및 기능적 연구에 적합한 제브라 피쉬 심장 및 혈관 근육 세포의 분리 방법론을 설명합니다. 이 접근법은 제브라피쉬 심실 근세포 분리 5,6에 대해 이전에 보고된 프로토콜의 수정을 포함하고 포유류 VSM 세포 분리8의 방법을 적용하여 구근 동맥(BA)에서 제브라피쉬 혈관 평활근 세포를 분리할 수 있습니다. 이 프로토콜은 최대 8 h9 동안 패치 클램프 연구에 안정적으로 사용할 수있는 제브라 피쉬에서 분리 된 심방, 심실 및 VSM 세포의 효율적인 수율을 제공합니다.
부모 유기체 외부에서 완전히 발달하는 거의 투명한 유충에도 불구하고 심혈관 발달을 연구하는 데있어 약속 된 개체 유전 학적 잠재력을 탐구하는 것은 어린 나이에 조직을 추출하고 분석하는 데 어려움을 겪었습니다. 현재 기사는 적응되고 발표 된 추출 방법10을 사용하여 수정 후 3 일 (dpf)에 분리 된 제브라 피쉬 심장에 대한 패치 클램프 실험을 시연함으로써 이러한 한계를 해결합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
배양 또는 전기 생리 학적 연구를 위해 근육 세포를 생성하는 것을 목표로하는 제브라 피쉬 심실 근육 세포 5,6을 분리하기위한 이전 방법은 낮은 수율의 세포를 제공하고 세포 품질 및 생존력에 악영향을 미치는 다중 원심 분리의 긴 단계를 포함했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 신뢰할 수 있으며 중요한 심혈관 조직 (심실, 심방 및 VSM) 각각을 다루…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 CGN에 대한 NIH 보조금 HL140024 및 CMC에 HL150277에 의해 지원되었습니다. 그림 1과 그림 2는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish’s swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
