電気生理学的研究のための成体、幼若、幼虫および胚性ゼブラフィッシュからの心臓および血管平滑筋細胞の単離(英語)
Summary
本プロトコルは、電気生理学的研究に適した、成体、幼若、幼虫、および胚性ゼブラフィッシュ(Danio rerio)からの生存可能な心臓および血管平滑筋細胞の急性単離を記載している。
Abstract
ゼブラフィッシュは、心臓血管研究におけるモデル脊椎動物生物として長い間使用されてきました。ゼブラフィッシュの心血管組織から個々の細胞を単離することの技術的困難は、それらの電気生理学的特性を研究する上で制限されてきた。ゼブラフィッシュ心臓の解剖および心室心筋細胞の単離については、以前の方法が記載されている。しかしながら、電気生理学的特性評価のためのゼブラフィッシュ心房および血管筋細胞の単離は詳述されていなかった。この研究では、パッチクランプ実験に適した、単離された幼体および成体のゼブラフィッシュの心室および心房心筋細胞、ならびに球根状動脈からの血管平滑筋(VSM)細胞を日常的に提供する新規および修正された酵素プロトコルについて説明します。発生の胚および幼虫段階で分離されたゼブラフィッシュの心血管組織に関する電気生理学的研究の文献的証拠はありません。幼虫および胚の心臓からの個々の細胞に対するパッチクランプ実験を可能にする部分解離技術が実証されています。
Introduction
ゼブラフィッシュは小型硬骨魚類であり、長い間モデル脊椎動物として使用されてきました1、そして最近、遺伝子や薬物のハイスループットスクリーニングのための実行可能な脊椎動物システムとして目立つようになりました2,3。しかし、ゼブラフィッシュ組織の生理学的分析は十分に発達していません。心血管系では、ゼブラフィッシュ心臓4の解剖および心室心筋細胞5,6,7の単離のための方法が記載されている。心房筋細胞の効果的な単離に関する詳細な説明はほとんどなく、パッチクランプ研究のための血管平滑筋(VSM)製剤の報告もありません。.
現在の研究では、電気生理学的および機能的研究に実行可能なゼブラフィッシュの心臓および血管筋細胞の単離のための方法論について説明しています。このアプローチには、ゼブラフィッシュ心室筋細胞単離のための以前に報告されたプロトコルの変更が含まれ5,6、哺乳類VSM細胞分離8からの方法を適応させ、球根状動脈(BA)からのゼブラフィッシュ血管平滑筋細胞の単離を可能にします。このプロトコルにより、ゼブラフィッシュから単離された心房、心室、およびVSM細胞を効率的に取得でき、パッチクランプ試験で最大8時間9確実に使用できます。
完全に親生物の外で発達するほぼ透明な幼虫にもかかわらず、心血管発達の研究における有望な個体発生の可能性を探求することは、若い年齢で組織を抽出し分析する際の課題によって制限されてきました。現在の記事では、適応された公開された抽出方法10を使用して、受精後3日(dpf)に分離されたゼブラフィッシュの心臓のパッチクランプ実験を実証することにより、この制限に対処します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュ心室筋細胞を単離する以前の方法5,6は、培養または電気生理学的研究のために筋細胞を生成することを目的としており、より低い収量の細胞を提供し、細胞の品質および生存率に悪影響を及ぼす複数回の遠心分離の長いステップを伴った。ここで説明するプロトコルは信頼性が高く、重要な心血管組織(心室、心房、およびVSM)のそ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIHがCGNにHL140024を、CMCにHL150277を付与したことで支援されました。図 1 と図 2 は BioRender.com を使用して作成されました。
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish’s swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
