Isolamento di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali per studi elettrofisiologici
Summary
Il presente protocollo descrive l’isolamento acuto di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari vitali da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali (Danio rerio), adatti per studi elettrofisiologici.
Abstract
I pesci zebra sono stati a lungo utilizzati come organismo vertebrato modello nella ricerca cardiovascolare. Le difficoltà tecniche di isolare le singole cellule dai tessuti cardiovascolari del pesce zebra sono state limitanti nello studio delle loro proprietà elettrofisiologiche. Sono stati descritti metodi precedenti per la dissezione dei cuori di zebrafish e l’isolamento dei miociti cardiaci ventricolari. Tuttavia, l’isolamento dei miociti atriali e vascolari del pesce zebra per la caratterizzazione elettrofisiologica non è stato dettagliato. Questo lavoro descrive protocolli enzimatici nuovi e modificati che forniscono abitualmente cardiomiociti ventricolari e atriali giovanili e adulti isolati, nonché cellule di muscolo liscio vascolare (VSM) dall’arterioso bulboso, adatte per esperimenti patch-clamp. Non ci sono state prove letterarie di studi elettrofisiologici su tessuti cardiovascolari di zebrafish isolati negli stadi di sviluppo embrionale e larvale. Vengono dimostrate tecniche di dissociazione parziale che consentono esperimenti patch-clamp su singole cellule di cuori larvali ed embrionali.
Introduction
I pesci zebra sono piccoli pesci teleostei che sono stati a lungo utilizzati come organismo vertebrato modello1 e recentemente sono venuti alla ribalta come un sistema vertebrato vitale per lo screening ad alto rendimento di geni e farmaci 2,3. Tuttavia, l’analisi fisiologica dei tessuti zebrafish non è ben sviluppata. Nel sistema cardiovascolare sono stati descritti metodi per la dissezione dei cuori di zebrafish4 e l’isolamento dei miociti cardiaci ventricolari 5,6,7. Ci sono poche descrizioni dettagliate dell’efficace isolamento dei miociti atriali e nessuna segnalazione di preparazioni di muscolatura liscia vascolare (VSM) per studi patch-mord.
Il lavoro attuale descrive la metodologia per l’isolamento dei miociti cardiaci e vascolari del pesce zebra, praticabile per studi elettrofisiologici e funzionali. Questo approccio include modifiche dei protocolli precedentemente riportati per l’isolamento dei miociti ventricolari 5,6 del pesce zebra e adatta i metodi dagli isolamenti delle cellule VSM dei mammiferi8, consentendo l’isolamento delle cellule muscolari lisce vascolari del pesce zebra dall’arterioso bulboso (BA). I protocolli si traducono in rese efficienti di cellule atriali, ventricolari e VSM isolate da zebrafish che possono essere utilizzate in modo affidabile negli studi patch-clamp per un massimo di 8 ore9.
Nonostante le loro larve quasi trasparenti si sviluppino interamente al di fuori dell’organismo parentale, esplorare il loro potenziale ontogenetico promesso nello studio dello sviluppo cardiovascolare è stato limitato dalle sfide nell’estrazione e nell’analisi dei tessuti in giovane età. L’articolo attuale affronta questa limitazione dimostrando esperimenti patch-clamp su cuori di zebrafish isolati già 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), utilizzando un metodo di estrazione adattato e pubblicato10.
Protocol
Representative Results
Discussion
I precedenti metodi per isolare i miociti ventricolari 5,6 del pesce zebra, volti a generare miociti per studi di coltura o elettrofisiologici, hanno fornito cellule di resa inferiore e hanno comportato lunghi passaggi di centrifugazioni multiple che hanno influito negativamente sulla qualità e sulla vitalità cellulare. I protocolli qui descritti sono affidabili, coprono ciascuno dei tessuti cardiovascolari significativi (ventricolo, atri e VSM) e, soprattutto,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH HL140024 a CGN e HL150277 a CMC. La Figura 1 e la Figura 2 sono state create con BioRender.com.
Materials
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
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