Моделирование паракринной неканонической сигнализации Wnt in vitro
Summary
В настоящем исследовании излагается высоковоспроизводимый и поддающийся лечению метод изучения паракринных неканонических сигнальных событий Wnt in vitro. Этот протокол был применен для оценки влияния паракринной передачи сигналов Wnt5a на клетки нервного гребня мышей и миобласты.
Abstract
Неканоническая передача сигналов Wnt регулирует внутриклеточную организацию актиновой нити и поляризованную миграцию клеток-предшественников во время эмбриогенеза. Этот процесс требует сложных и скоординированных паракринных взаимодействий между сигнальными и сигнальными клетками. Учитывая, что эти взаимодействия могут происходить между различными типами клеток из разных линий, оценка in vivo клеточных специфических дефектов может быть сложной задачей. Настоящее исследование описывает высоковоспроизводимый метод оценки паракринной неканонической передачи сигналов Wnt in vitro. Этот протокол был разработан с возможностью (1) проведения функциональных и молекулярных оценок неканонической передачи сигналов Wnt между любыми двумя типами клеток, представляющими интерес; (2) проанализировать роль молекул, посылающих сигнал, по сравнению с молекулами, принимающими сигнал в неканоническом сигнальном пути Wnt; и (3) проводить фенотипические спасательные эксперименты со стандартными молекулярными или фармакологическими подходами.
Этот протокол использовался для оценки неканонической передачи сигналов Wnt в миобластах, опосредованной нейронными гребневыми клетками (NCC). Наличие NCC связано с увеличением числа фаллоидин-положительных цитоплазматических филоподий и ламеллиподий в миобластах и улучшенной миграцией миобластов в ранозаживляющем анализе. Ось Wnt5a-ROR2 была идентифицирована как важнейший неканонический сигнальный путь Wnt между NCC и кардиомиобластами второго поля сердца (SHF). В заключение, это очень удобный протокол для изучения паракринных неканонических сигнальных механизмов Wnt in vitro.
Introduction
Неканоническая передача сигналов Wnt является эволюционно сохраненным путем, который регулирует организацию клеточной нити и направленную миграцию. Этот путь был вовлечен в многочисленные биологические процессы, включая морфогенез эмбриональной ткани 1,2,3, лимфатический и сосудистый ангиогенез 4,5,6,7 и рост рака и метастазирование 8,9,10 . На клеточном уровне неканоническая сигнализация Wnt осуществляется посредством скоординированных паракринных взаимодействий между сигнально-посылающими и принимающими сигнал клетками. Эти взаимодействия часто происходят между клетками разных линий или типов и включают разнообразную молекулярную сеть, которая включает в себя до 19 лигандов и множественные рецепторы, коорецепторы и эффекторы трансдукции нисходящего сигнала11. Еще больше усложняя этот процесс передачи сигналов, предыдущие исследования показали, что комбинации лиганд-рецептор могут изменяться в зависимости от контекста и ткани12,13, и что одни и те же исходные лиганды, которые управляют неканонической передачей сигналов Wnt в клетках, принимающих сигнал, могут быть произведены несколькими типами сигнальных клеток14,15 . Учитывая клеточную и молекулярную сложность, связанную с неканонической передачей сигналов Wnt, способность изучать индивидуальные и клинически значимые механизмы in vivo была ограничена.
Были предприняты попытки изучить неканоническую передачу сигналов Wnt с использованием методов клеточной культуры in vitro. Например, ранозаживляющие анализы, выполненные в клеточных монослоях, использовались для функциональной оценки клеточной направленной миграции 4,16,17,18,19. Методы иммуноокрашения были использованы для выполнения пространственного анализа экспрессии поверхностного белка для оценки неканонических Wnt-индуцированных изменений в клеточной морфологии 7,10, архитектуре и асимметричной поляризации 18,19,20. Хотя эти подходы предоставили важные инструменты для характеристики фенотипов, связанных с Wnt, в клетках, принимающих сигнал, отсутствие компонентов, посылающих сигнал в этих протоколах, ограничивает их способность точно моделировать паракринные сигнальные механизмы, наблюдаемые in vivo. В результате сохраняется острая необходимость в разработке систем in vitro, которые позволяют надежно и воспроизводимо оценивать паракринные сигнальные взаимодействия между сигнальными и принимающими клетками неканонического пути Wnt, особенно с различными типами клеток.
С этой целью основной целью данного исследования было создание протокола для моделирования паракринных неканонических сигнальных взаимодействий Wnt in vitro. Мы разработали бесконтактную систему кокультуры, которая рекапитулирует сигнально-посылающие и сигнально-принимающие компоненты этих взаимодействий и позволяет использовать стандартные молекулярные, генетические или фармакологические подходы для независимого изучения специфических лиганд-рецепторных механизмов в неканоническом пути Wnt. Механизмы NCC-опосредованной передачи Wnt были исследованы в миобластах с использованием установленных линий мышиных клеток. В качестве доказательства принципа эта модель была использована для подтверждения результатов предыдущих исследований in vivo на мышах, которые подразумевают ось Wnt5a-ROR2 в качестве соответствующего неканонического сигнального пути Wnt между NCC21 и предшественниками кардиомиобластов SHF 3,22,23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Неканонический сигнальный путь полярности Wnt/планарных клеток (PCP) является критически важным клеточным сигнальным путем, который был вовлечен в множественные процессы развития24,25 и болезни24,26. Во время эмбрионального раз…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана наградами NIH F30HL154324 для O.T. и K08HL121191 и R03HL154301 для S.R.K. Авторы хотели бы признать, что схема на рисунке 1 в этой рукописи была создана с biorender.com.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
- Ho, H. Y. H., et al. Wnt5a-Ror-Dishevelled signaling constitutes a core developmental pathway that controls tissue morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (11), 4044-4051 (2012).
- Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of noncanonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. (8), 42093 (2019).
- Li, D., et al. Planar cell polarity signaling regulates polarized second heart field morphogenesis to promote both arterial and venous pole septation. Development. 146 (20), 181719 (2019).
- Lutze, G., et al. Noncanonical WNT-signaling controls differentiation of lymphatics and extension lymphangiogenesis via RAC and JNK signaling. Scientific Reports. 9 (1), 4739 (2019).
- Buttler, K., et al. Maldevelopment of dermal lymphatics in Wnt5a-knockout-mice. Developmental Biology. 381 (2), 365-376 (2013).
- Betterman, K. L., et al. Atypical cadherin FAT4 orchestrates lymphatic endothelial cell polarity in response to flow. Journal of Clinical Investigation. 130 (6), 3315-3328 (2020).
- Descamps, B., et al. Frizzled 4 regulates arterial network organization through noncanonical Wnt/planar cell polarity signaling. Circulation Research. 110 (1), 47-58 (2012).
- Weeraratna, A. T., et al. Wnt5a signaling directly affects cell motility and invasion of metastatic melanoma. Cancer Cell. 1 (3), 279-288 (2002).
- Henry, C., et al. Expression of the novel Wnt receptor ROR2 is increased in breast cancer and may regulate both β-catenin dependent and independent Wnt signalling. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (2), 243-254 (2014).
- Anastas, J. N., et al. A protein complex of SCRIB, NOS1AP and VANGL1 regulates cell polarity and migration, and is associated with breast cancer progression. Oncogene. 31 (32), 3696-3708 (2012).
- Niehrs, C. The complex world of WNT receptor signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (12), 767-779 (2012).
- Dong, B., et al. Functional redundancy of frizzled 3 and frizzled 6 in planar cell polarity control of mouse hair follicles. Development. 145 (19), (2018).
- Bernascone, I., et al. Sfrp3 modulates stromal-epithelial crosstalk during mammary gland development by regulating Wnt levels. Nature Communications. 10 (1), 2481 (2019).
- Hendrickx, G., et al. WNT16 requires Gα subunits as intracellular partners for both its canonical and noncanonical WNT signalling activity in osteoblasts. Calcified Tissue International. 106 (3), 294-302 (2020).
- Avgustinova, A., et al. Tumour cell-derived Wnt7a recruits and activates fibroblasts to promote tumour aggressiveness. Nature Communications. (7), 10305 (2016).
- Tseng, J. C., et al. CAPE suppresses migration and invasion of prostate cancer cells via activation of noncanonical Wnt signaling. Oncotarget. 7 (25), 38010-38024 (2016).
- Wang, Q., et al. A novel role for Wnt/Ca2+ signaling in actin cytoskeleton remodeling and cell motility in prostate cancer. PLoS One. 5 (5), 10456 (2010).
- Gibbs, B. C., et al. Prickle1 mutation causes planar cell polarity and directional cell migration defects associated with cardiac outflow tract anomalies and other structural birth defects. Biology Open. 5 (3), 323-335 (2016).
- Cui, C., et al. a PCP protein required for ciliogenesis, regulates directional cell migration and cell polarity by direct modulation of the actin cytoskeleton. PLoS Biology. 11 (11), 1001720 (2013).
- Gombos, R., et al. The formin DAAM functions as molecular effector of the planar cell polarity pathway during axonal development in Drosophila. The Journal of Neuroscience. 35 (28), 10154-10167 (2015).
- Toubat, O., et al. Neural Crest Cell-derived Wnt5a Regulates Planar Cell Polarity in Cranial Second Heart Field Progenitor Cells. Circulation. 142, 12540 (2020).
- Li, D., et al. Spatial regulation of cell cohesion by Wnt5a during second heart field progenitor deployment. Developmental Biology. 412 (1), 18-31 (2016).
- Sinha, T., et al. Loss of Wnt5a disrupts second heart field cell deployment and may contribute to OFT malformations in DiGeorge syndrome. Human Molecular Genetics. 24 (6), 1704-1716 (2015).
- Humphries, A. C., et al. From instruction to output: Wnt/PCP signaling in development and cancer. Current Opinion in Cell Biology. (51), 110-116 (2018).
- Shi, D. L. Decoding Dishevelled-Mediated Wnt Signaling in Vertebrate Early Development. Frontiers in Cell and Developmental Biology. (8), 588370 (2020).
- Butler, M. T., et al. Planar cell polarity in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 375-388 (2017).
- Bradshaw, L., et al. Dual role for neural crest cells during outflow tract septation in the neural crest-deficient mutant Splotch2H. Journal of Anatomy. 214 (2), 245-257 (2009).
- Kodo, K., et al. Regulation of Sema3c and the interaction between cardiac neural crest and second heart field during outflow tract development. Scientific Reports. 7 (1), 6771 (2017).
- Waldo, K. L., et al. Cardiac neural crest is necessary for normal addition of the myocardium to the arterial pole from the secondary heart field. Developmental Biology. 281 (1), 66-77 (2005).
- Schleiffarth, J. R., et al. Wnt5a is required for cardiac outflow tract septation in mice. Pediatric Research. 61 (4), 386-391 (2007).
- Nguyen, B. H., et al. Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. Journal of Visualized Experiments. (140), e58346 (2018).
- Suarez-Arnedo, A., et al. An image J plugin for the high throughput image analysis of in vitro scratch wound healing assays. PLoS One. 15 (7), 0232565 (2020).
- Martinotti, S., et al. Scratch wound healing assay. Methods in Molecular Biology. (2109), 225-229 (2020).
