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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Modelagem de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro

Published: December 10, 2021 doi: 10.3791/63247
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3
1Department of Surgery, Keck School of Medicine of USC, 2Department of Pediatrics, Keck School of Medicine of USC, 3Heart Institute, Children’s Hospital Los Angeles

Summary

O presente estudo descreve um método altamente reprodutível e tratável para estudar eventos de sinalização Wnt não canônica parácrina in vitro. Este protocolo foi aplicado para avaliar o impacto da sinalização parácrina Wnt5a em células da crista neural murina e mioblastos.

Abstract

A sinalização Wnt não canônica regula a organização do filamento de actina intracelular e a migração polarizada de células progenitoras durante a embriogênese. Este processo requer interações parácrinas complexas e coordenadas entre as células de envio e recepção de sinal. Dado que essas interações podem ocorrer entre vários tipos de células de diferentes linhagens, a avaliação in vivo de defeitos específicos da célula pode ser um desafio. O presente estudo descreve um método altamente reprodutível para avaliar a sinalização de Wnt parácrina não canônica in vitro. Este protocolo foi projetado com a capacidade de (1) realizar avaliações funcionais e moleculares de sinalização Wnt não canônica entre quaisquer dois tipos de células de interesse; (2) dissecar o papel das moléculas de envio de sinal versus moléculas receptoras de sinal na via de sinalização Wnt não canônica; e (3) realizar experimentos de resgate fenotípico com abordagens moleculares ou farmacológicas padrão.

Este protocolo foi utilizado para avaliar a sinalização Wnt não canônica mediada por células da crista neural (NCC) em mioblastos. A presença de NCCs está associada a um aumento do número de filopódios citoplasmáticos positivos para faloidina e lamellipodos nos mioblastos e à melhora da migração mioblástica em um ensaio de cicatrização de feridas. O eixo Wnt5a-ROR2 foi identificado como uma via de sinalização Wnt não canônica crucial entre os progenitores de cardiomioblastos NCC e do segundo campo cardíaco (SHF). Em conclusão, este é um protocolo altamente tratável para estudar mecanismos de sinalização Wnt não canônicos parácrinos in vitro.

Introduction

A sinalização Wnt não canônica é uma via conservada evolutivamente que regula a organização do filamento celular e a migração direcional. Essa via tem sido implicada em múltiplos processos biológicos, incluindo morfogênese do tecido embrionário 1,2,3, angiogênese linfática e vascular 4,5,6,7 e crescimento e metástase do câncer 8,9,10 . No nível celular, a sinalização Wnt não canônica é realizada através de interações parácrinas coordenadas entre as células emissoras e receptoras de sinal. Essas interações ocorrem frequentemente entre células de diferentes linhagens ou tipos e envolvem uma rede molecular diversificada que inclui até 19 ligantes e múltiplos receptores, co-receptores e efetores de transdução de sinal a jusante11. Complicando ainda mais esse processo de sinalização, estudos anteriores mostraram que as combinações ligante-receptor podem variar de maneira dependente do contexto e do tecido 12,13, e que os mesmos ligantes de origem que acionam a sinalização Wnt não canônica em células receptoras de sinal podem ser produzidos por múltiplos tipos de células emissoras de sinal 14,15 . Dada a complexidade celular e molecular associada à sinalização Wnt não canônica, a capacidade de estudar mecanismos individuais e clinicamente relevantes in vivo tem sido limitada.

Tentativas têm sido feitas para estudar a sinalização Wnt não canônica usando técnicas de cultura de células in vitro. Por exemplo, ensaios de cicatrização de feridas realizados em monocamadas celulares têm sido utilizados para avaliar funcionalmente a migração direcional celular 4,16,17,18,19. Técnicas de imunocoloração têm sido utilizadas para realizar análises espaciais da expressão de proteínas de superfície para avaliar alterações não canônicas induzidas por Wnt na morfologia celular 7,10, arquitetura e polarização assimétrica18,19,20. Embora essas abordagens tenham fornecido ferramentas importantes para caracterizar fenótipos relacionados à Wnt em células receptoras de sinal, a falta de componentes emissores de sinal nesses protocolos limita sua capacidade de modelar com precisão os mecanismos de sinalização parácrina observados in vivo. Como resultado, permanece uma necessidade crítica de desenvolver sistemas in vitro que permitam uma avaliação robusta e reprodutível das interações de sinalização parácrina entre células emissoras e receptoras de sinais da via Wnt não canônica, particularmente aquelas de diferentes tipos celulares.

Para tanto, o objetivo primário deste estudo foi estabelecer um protocolo para modelar interações de sinalização Wnt não canônicas parácrinas in vitro. Desenvolvemos um sistema de cocultura sem contato que recapitula os componentes de envio e recepção de sinal dessas interações e permite o uso de abordagens moleculares, genéticas ou farmacológicas padrão para estudar independentemente mecanismos específicos de ligantes-receptores na via Wnt não canônica. Os mecanismos de sinalização Wnt mediada por NCC foram examinados em mioblastos usando linhagens celulares murinas estabelecidas. Como prova de princípio, este modelo foi utilizado para corroborar achados de estudos in vivo prévios em camundongos que implicam o eixo Wnt5a-ROR2 como uma via de sinalização Wnt não canônica relevante entre os NCCs21 e os progenitores cardiomioblastos SHF 3,22,23.

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Protocol

1. Expansão pré-experimental e passagem de células

  1. Cultura de células C2C12:
    1. Preparar 500 mL de meio de cultura C2C12 combinando o meio Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina.
    2. Descongele um frasco para injetáveis de células C2C12 em banho-maria de 37 °C. Enquanto as células C2C12 estão descongelando, adicione 5 mL de meio C2C12 a um tubo cônico de 15 mL. Transfira imediatamente as células descongeladas para o tubo de 15 mL usando uma pipeta P1000.
      NOTA: As células C2C12 são células mioblásticas murinas que foram previamente usadas e validadas como uma linhagem celular primária para modelar progenitores cardiomioblastos.
    3. Misture suavemente as células C2C12 no tubo cônico usando uma pipeta sorológica. Em seguida, adicionar todo o volume de células descongeladas em meio C2C12 (6 ml) a um balão de 75 cm2 .
    4. Adicionar 6 ml de meio fresco de C2C12 ao balão para um volume total de 12 ml. Girar suavemente o balão de modo a que a solução celular e o meio cubram todo o fundo do balão. Colocar o balão numa incubadora de cultura celular (37 °C, 5% de CO2) para permitir a adesão das células.
    5. Permita que as células se expandam na incubadora até atingirem ~60% de confluência.
      NOTA: Isso pode ser determinado removendo periodicamente as células da incubadora e verificando rapidamente sua confluência sob um microscópio. Certifique-se de minimizar o tempo que as células são removidas da incubadora.
  2. Células C2C12 de passagem:
    1. Aqueça o meio C2C12, 500 mL de PBS 1x e tripsina-EDTA a 0,25% em banho-maria de 37 °C. Depois que os reagentes tiverem sido aquecidos, transfira todos os reagentes para o exaustor de cultura celular.
    2. Levar o balão contendo as células C2C12 para o exaustor de cultura celular. Enxaguar suavemente o balão que contém as células C2C12 com 1x PBS morno duas vezes.
      1. Inclinar o balão num ângulo de 45° e aspirar o meio C2C12 com uma pipeta de vidro ligada à aspiração a vácuo. Mantendo um ângulo de 45°, adicionar cuidadosamente 10 ml de PBS 1x quente ao canto do balão utilizando uma pipeta serológica. Colocar o balão plano sobre a superfície e mover suavemente o balão em movimentos circulares para garantir que o PBS 1x lava toda a monocamada de células.
        NOTA: Tenha cuidado para não interromper a monocamada C2C12 durante a aspiração do meio.
    3. Remova o PBS 1x após a segunda lavagem. Adicionar 1 ml de tripsina-EDTA a 0,25% ao balão, mover suavemente o balão como acima descrito para permitir que a solução de tripsina-EDTA se espalhe pelo maior número possível da monocamada e coloque o balão na incubadora durante 2 minutos.
    4. Após 2 min de incubação, retirar o balão da incubadora e bater-lhe suavemente para desprender as células restantes.
    5. Adicionar 9 ml de meio C2C12 ao balão com uma pipeta serológica para extinguir a tripsina. Usando a pipeta sorológica, lave suavemente as células com o meio e colete os 10 mL de suspensão celular tripsinizada. Adicionar 10 ml da suspensão celular a um tubo cónico fresco de 15 ml e centrifugar a 100 × g durante 5 min.
    6. Devolva o tubo cónico ao exaustor de cultura celular e remova o sobrenadante com uma pipeta de vidro ligada à aspiração a vácuo. Ao aspirar o sobrenadante, tome cuidado para não interromper a pastilha celular no fundo do tubo cônico. Para fazer isso, deixe ~0,2 mL do sobrenadante no tubo cônico. Ressuspender as células em 10 mL de meio C2C12 fresco.
    7. Para uma passagem adicional, adicionar 1 ml das células ressuspensas num balão de 75 cm2 . Adicionar 11 ml de meio C2C12 ao balão com uma pipeta serológica e colocar o balão na incubadora.
  3. Cultura de células STO:
    1. Prepare o meio de cultura STO produzindo 500 mL de DMEM com 7% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina e 2 nM de L-glutamina.
    2. Prepare gelatina a 0,1% adicionando 0,5 g de gelatina em pó a um frasco contendo 500 ml de água de grau tecidual ou autoclavada. Adicionar 7 ml de solução de gelatina a 0,1% a um balãode 75 cm 2 . Girar o balão de modo a que a solução de gelatina cubra todo o fundo do balão. Deixar o balão incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente no exaustor de cultura celular.
    3. Após 30 minutos de incubação, remova o excesso de gelatina usando uma pipeta conectada à sucção a vácuo. Deixe os frascos permanecerem na incubadora por mais 30 minutos antes do uso.
    4. Descongele um frasco para injetáveis de células STO num banho de água a 37 °C. Usando uma pipeta P1000, transfira imediatamente as células descongeladas para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de meio de cultura STO recém-preparado.
      NOTA: As células STO são fibroblastos embrionários murinos rotineiramente utilizados como células alimentadoras em protocolos de cultura celular.
    5. Misture suavemente as células no tubo cônico usando uma pipeta sorológica. Adicionar todo o volume (6 ml) de células a um balão de 75 cm2 revestido de gelatina. Girar o balão para garantir que a suspensão celular está bem distribuída ao longo do fundo do balão.
    6. Adicionar 6 ml de meio STO fresco ao balão para um volume total de 12 ml. Girar o balão como acima descrito, a fim de assegurar que as células e o meio estejam bem distribuídos ao longo do fundo do balão. Colocar o balão na incubadora de 37 °C para permitir a adesão das células. Permita que as células proliferem na incubadora até atingirem ~60-70% de confluência.
  4. Células STO de passagem:
    1. Meio de células STO quentes, 1xPBS e tripsina-EDTA a 0,25% em banho-maria a 37 °C.
    2. Enxaguar suavemente o balão que contém células STO com PBS 1x quente duas vezes, tal como descrito na etapa 1.2.2.1.
    3. Adicionar 1 ml de tripsina-EDTA a 0,25% ao balão utilizando uma pipeta P1000. Colocar o balão na incubadora de 37 °C durante 5 min.
    4. Após 5 min de incubação, retirar o balão da incubadora. Bater suavemente no balão para desprender as células aderentes.
    5. Adicionar 9 ml de meio STO ao balão para extinguir a tripsina e recolher os 10 ml de suspensão celular tripsinizada, conforme descrito acima. Adicionar 10 ml da suspensão celular a um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 100 × g durante 5 min.
    6. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL de meio STO, conforme descrito acima. Para uma passagem adicional, adicionar 1 ml das células ressuspensas num balão de 75 cm2 . Adicionar 11 ml de meio STO, rodar o balão de modo a assegurar uma distribuição uniforme das células e do meio ao longo do fundo do balão e colocar o balão na incubadora.
  5. Cultura de células STO inativas e preparação de meio basal de células O9-1:
    1. Preparar o meio de cultura basal de células O9-1 misturando 500 mL de DMEM com FBS a 15%, penicilina/estreptomicina a 1%, L-glutamina a 2 nM, aminoácidos não essenciais mínimos de 0,1 mM, piruvato de sódio a 1 nM e beta-mercaptoetanol a 55 μM.
    2. Preparar a solução de mitomicina C em 1x PBS a uma concentração de 0,5 mg/ml adicionando 4 ml de 1x PBS diretamente a um frasco para injetáveis de mitomicina C. Pipetar a solução várias vezes com uma pipeta P1000. Para dissolver ainda mais a mitomicina C em 1x PBS, coloque o frasco para injetáveis num misturador de vórtice ou balancim de bancada durante 45 min a 1 h.
    3. Inativar as células STO tratando as placas STO com uma concentração final de 0,01 mg/mL de mitomicina C adicionada ao meio STO padrão. Colocar as placas STO no interior da incubadora durante 2 h, tendo o cuidado de proteger o balão contendo mitomicina C da luz, minimizando o tempo passado fora da incubadora. Após o tratamento com mitomicina, lavar as células em 1x PBS duas vezes, conforme descrito na etapa 1.2.2.1.
      NOTA: A mitomicina C inibe a proliferação de células STO para que possam ser utilizadas para gerar meio condicionado durante vários dias sem se tornarem sobreconfluentes no balão.
    4. Após a remoção do PBS 1x, adicionar 12 mL de meio de cultura basal O9-1 às culturas de células STO inativadas e incubá-las por 24 h. Recolher o meio de cultura basal STO + O9-1 condicionado e inativado e colocá-lo em tubos cónicos de 50 ml envoltos em papel alumínio para o proteger da luz.
    5. Adicione 12 mL de meio de cultura basal de O9-1 fresco às culturas de células STO inativadas, conforme descrito acima. Repita esta etapa adicionando um meio de cultura basal de O9-1 fresco aos mesmos flancos contendo as células STO inativadas a cada 24 h.
      NOTA: Após o tratamento com mitomicina C, as células STO inativadas não podem proliferar; portanto, os frascos contendo as células STO inativadas podem ser reutilizados para gerar meio condicionado.
    6. Conservar os tubos cónicos de 50 ml embrulhados em folha contendo meio de cultura basal STO + O9-1 condicionado e inactivado a 4 °C até que um total de 500 ml do meio tenha sido recolhido.
  6. Cultura de células de O9-1:
    1. Preparar o meio de cultura de crescimento celular O9-1 usando 500 mL de meio basal condicionado STO + O9-1 e adicionar 103 unidades de fator inibitório de leucemia (LIF) e 25 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos (FGF básico).
    2. Preparar frascos revestidos de gelatina a 0,1%, conforme descrito nos passos 1.3.2-1.3.3.
    3. Descongele um frasco para injetáveis de células O9-1 num banho de água a 37 °C. Transferir imediatamente as células descongeladas para um tubo cónico de 15 ml contendo 5 ml de meio de crescimento O9-1 acabado de preparar.
      NOTA: A linhagem celular O9-1 é a única linhagem celular estável e multipotente da crista neural que foi gerada a partir do rato. Esta linhagem celular é comumente usada em experimentos in vitro de crista neural.
    4. Misture suavemente as células usando uma pipeta sorológica. Adicionar a totalidade dos 6 ml de células a um balão de 75 cm2 revestido de gelatina.
    5. Adicionar 6 ml de meio de crescimento O9-1 ao balão para um volume total de 12 ml. Colocar o balão na incubadora de 37 °C para permitir a adesão das células. Permita que as células proliferem na incubadora até atingirem ~60-70% de confluência.
  7. Passando células O9-1:
    1. Meio de crescimento de O9-1 quente, 1x PBS e tripsina-EDTA a 0,25% em banho-maria a 37 °C.
    2. Enxaguar suavemente a placa que contém células O9-1 com PBS 1x quente duas vezes, conforme descrito na etapa 1.2.2.1.
    3. Adicionar 1 ml de tripsina-EDTA a 0,25% ao balão e colocá-lo na incubadora a 37 °C durante 5 minutos.
    4. Após 5 min de incubação, retirar o balão da incubadora e bater suavemente no balão para descolar as células aderentes.
    5. Adicionar 9 ml de meio de crescimento O9-1 ao balão para extinguir a tripsina. Recolher 10 ml da suspensão celular tripsinizada e adicionar 10 ml desta suspensão celular a um tubo cónico de 15 ml. Centrifugar o tubo a 100 × g durante 5 min.
    6. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 10 mL de meio de crescimento O9-1. Para uma passagem adicional, adicionar 1 ml de células ressuspensas a um balão de 75 cm2 . Adicionar 11 ml de meio de crescimento O9-1 e colocar o balão contendo as células em 12 ml de meio na incubadora a 37 °C.

2. Planear células em um sistema de cocultura

  1. Chapeamento de câmaras celulares C2C12:
    1. Após a tripsinização (conforme descrito na etapa 1.2), ressussuscite o pellet de células C2C12 em 10 mL de meio C2C12. Diluir as células numa proporção de 1:20 em meio C2C12, removendo 0,5 ml das células C2C12 ressuspensas e adicionando-as a um novo tubo cónico de 15 ml contendo 9,5 ml de meio C2C12 fresco. Misture suavemente a suspensão com uma pipeta serológica.
    2. Adicione 1 mL das células C2C12 diluídas em 1:20 a cada poço de um novo poço de 4 câmaras usando uma pipeta P1000 e coloque o poço de 4 câmaras na incubadora.
  2. Inserções de células O9-1 de chapeamento:
    1. Após tripsinização, ressuspender o pellet de células O9-1 em 10 mL de meio de crescimento O9-1. Diluir as células numa proporção de 1:20 em meio de crescimento O9-1 removendo 0,5 ml das células C2C12 ressuspensas e adicionando-as a um novo tubo cónico de 15 ml contendo 9,5 ml de meio de crescimento fresco de O9-1. Misture suavemente a suspensão com uma pipeta serológica.
    2. Coloque uma única inserção permeável (ver Tabela de Materiais) dentro de cada poço de um novo poço de 4 câmaras preenchido com 1 mL de meio de crescimento O9-1.
      NOTA: Este poço de 4 câmaras deve ser diferente do que contém as células C2C12 do passo 2.1.3.
    3. Adicionar 300 μL da suspensão de células O9-1 diluídas a cada pastilha utilizando uma pipeta P1000. Certifique-se de que o fundo de cada pastilha está submerso dentro do poço preenchido com 1,3 mL de meio de crescimento O9-1. Colocar o poço na incubadora a 37 °C.
  3. (Opcional). Execute o knockdown de siRNA nas células O9-1 ou C2C12.
    1. Realizar a derrubada do gene pelo siRNA 18-24 h após o revestimento das inserções celulares O9-1 ou dos poços da câmara celular C2C12.
      1. Diluir o siRNA e o reagente de transfecção em meio sérico reduzido (ver Tabela de Materiais) de acordo com as recomendações dos fabricantes e as concentrações desejadas para o experimento. Misturar suavemente o siRNA diluído e o reagente de transfecção (1:1) e incubar a mistura à temperatura ambiente durante 7 min.
        NOTA: Neste protocolo, foram utilizadas concentrações de 50 nM, uma vez que esta concentração de siRNA foi determinada para resultar numa quebra suficiente da expressão do gene alvo.
      2. Adicione os complexos siRNA-lipídicos às inserções celulares de O9-1 ou aos poços de câmara celular C2C12, conforme determinado pelo projeto experimental, e incube as células com os complexos siRNA-lipídicos por ~36-48 h.

3. Realização de ensaio de feridas e avaliação quantitativa da migração mioblástica

  1. Ensaio de ferida:
    1. Permita que as inserções de células O9-1 e os poços de câmara celular C2C12 adiram e proliferem na incubadora até que ambas as células estejam em ~70-80% de confluência antes de prosseguir com esta parte do protocolo. Se as células crescerem >90% confluentes, não prossiga com o ensaio de arranhões, pois as células simplesmente se desprenderão do poço.
    2. Aqueça 1x PBS e C2C12 médio, colocando-os em banho-maria de 37 °C.
    3. Remova bem o meio sobrenadante da câmara C2C12 e lave as células uma vez com 1x PBS. Remova o PBS 1x e risque imediatamente as células com uma ponta de pipeta P10 estéril.
      1. Passe firmemente a ponta da pipeta P10 estéril em uma única direção para abranger todo o comprimento ou largura da monocamada celular (por exemplo, da direita para a esquerda, de cima para baixo). Certifique-se de arranhar cada poço contendo células apenas uma vez.
        NOTA: Para otimizar os resultados de arranhões, arranhe poços de diferentes condições experimentais em um nível semelhante de confluência. Para fazer isso, certifique-se de que cada poço de 4 câmaras tenha células para cada condição experimental necessária (por exemplo, controle negativo do poço #1, controle positivo do poço #2). Além disso, use uma nova pipeta P10 estéril para cada arranhão e aplique uma quantidade semelhante de força à pipeta a cada vez. Não tente criar mais de um arranhão em cada poço.
      2. Depois de coçar, adicione rapidamente 1 mL de 1x PBS de volta ao poço usando uma ponta de pipeta P1000. Repita esse processo para cada poço que será riscado.
        NOTA: Dada a variabilidade associada a cada arranhão, recomenda-se que múltiplos poços (n = 3) sejam utilizados para a criação de feridas em cada condição experimental. Trabalhe rapidamente, pois é fundamental minimizar a duração durante a qual as células ficam sem 1x PBS durante essas etapas. Depois de remover 1x PBS de cada poço, não se deve tomar mais de 5 s para gerar uma ferida em cada poço.
    4. Depois de gerar uma ferida e adicionar 1x PBS de volta em cada poço, imagine o arranhão usando um microscópio invertido de campo brilhante e use essa imagem como o tamanho da ferida de linha de base (tempo 0). Para tirar imagens, execute as seguintes etapas:
      1. Ligue o computador e o microscópio (consulte a Tabela de materiais) pressionando o botão liga/desliga. Coloque o slide de câmara no palco e gire o mostrador da objetiva para uma ampliação de 5x.
      2. Abra o software de criação de imagens (consulte a Tabela de materiais) clicando duas vezes no ícone de software na área de trabalho do computador. Clique na guia Câmera na tela inicial do software. Clique no botão Live para visualizar as células na guia AxioCam IC .
      3. Certifique-se de que o filtro de luz é puxado todo o caminho para fora para permitir que a luz passe para a câmera e a tela do computador. Mova e/ou gire manualmente o slide da câmara para posicionar a área da ferida no centro da imagem ao vivo na guia AxioCam IC .
      4. Para tirar imagens, clique em Ajustar para abrir uma nova guia ao lado da guia AxioCam IC que contém a imagem.
      5. Para salvar essa imagem estática, clique em arquivo no canto superior esquerdo da página inicial do software | salvar como | digite o nome do arquivo na caixa Nome do arquivo. Salve a figura no formato de imagem Carl Zeiss (*.czi) (a configuração padrão) e selecione área de trabalho na barra à esquerda para salvar o arquivo na área de trabalho como um arquivo .czi, que só pode ser aberto no programa de software Zen lite 2012.
      6. Para salvar a imagem como um .tiff, clique em arquivo | salvar como | digite o nome do arquivo na caixa Nome do arquivo. Salve a figura como arquivo de imagem marcado (*.tiff) clicando no botão Salvar como tipo e selecionando *.tiff no menu suspenso.
        NOTA: O formato .tiff pode ser aberto em qualquer software de processamento de imagem.
      7. Reposicione manualmente a lâmina da câmara para tirar mais 2-3 imagens em outros pontos da ferida no mesmo poço.
        NOTA: No total, isso resultará em 3-4 imagens não sobrepostas e de alta ampliação da ferida em cada poço.
    5. Retire o PBS 1x de cada poço e adicione 1 mL de meio C2C12.
      NOTA: Tenha cuidado para não pipetar de forma muito agressiva ao remover ou adicionar soluções à câmara bem após a geração da ferida, pois isso pode fazer com que as células se despordem bem da câmara. Além disso, incline bem a câmara para que a aspiração e a reintrodução de soluções possam ser feitas nos cantos de cada poço para minimizar a ruptura da monocamada celular.
    6. Monte o sistema de cocultura de inserção de poços colocando manualmente as inserções contendo as células de O9-1 em cada poço do poço da câmara. Empurre suavemente as inserções para baixo no poço de modo que a parte inferior da inserção fique logo acima das células C2C12 subjacentes. Devolva as construções de inserção do poço à incubadora.
      NOTA: Não permita que a parte inferior da pastilha toque fisicamente e interrompa mecanicamente as células C2C12 subjacentes.
    7. Permita que as células migrem por um total de 9-12 h. Para determinar o tempo de migração ideal, verifique as células em 6 h após a criação da ferida, em seguida, a cada 2-3 h a partir de então. Termine o experimento quando as células em condições de controle ou controle positivo começarem a cobrir completamente a ferida.
      NOTA: Dada a natureza sem contato da construção, a inserção sobrejacente não precisa ser removida dos poços ao verificar a progressão da migração de intervalo. A variabilidade migratória será observada dependendo de fatores como os tipos de células usadas neste ensaio, a densidade celular no momento da geração da ferida, a largura da ferida criada e as condições experimentais das células manipuladas (por exemplo, knockdown de genes, adição de proteína recombinante). As concentrações destes reagentes devem ser determinadas experimentalmente com a orientação das recomendações do fabricante.

4. Coloração por imunofluorescência e imagem de mioblastos migratórios

  1. Encerrando o ensaio de migração e desconstruindo o sistema de inserção de poços:
    1. Remova as inserções de células O9-1 após um período de migração de 9-12 h (ou tempo alternativo designado por condições experimentais). Aspirar cuidadosamente o meio C2C12 utilizando uma pipeta P1000. Adicione 0,5 mL de 1x PBS aos poços da câmara e tire as imagens finais das células após a migração.
    2. Aspirar cuidadosamente todos os 0,5 mL de 1x PBS misturados com meio e remover as câmaras de plástico dos poços da câmara usando as instruções do kit, deixando a lâmina subjacente contendo as células C2C12.
      NOTA: Tenha cuidado para não interromper as células C2C12 aderentes à lâmina ao remover os poços da câmara.
  2. Realização de imunocoloração:
    1. Coloque imediatamente a lâmina num suporte de lâmina contendo 4% de paraformaldeído (PFA) e incube durante 10 minutos à temperatura ambiente. Despeje o PFA a 4% e adicione 0,1% de Triton X-100 contendo 1x PBS (1x PBST) ao suporte da lâmina para lavar a lâmina por 15 min à temperatura ambiente. Despeje o PBST 1x e adicione 1x PBS ao suporte da lâmina para lavar a lâmina por 10 minutos à temperatura ambiente. Repita esta etapa mais uma vez para um total de duas lavagens PBS 1x.
    2. Remova o slide do suporte do slide. Trace as bordas externas do slide com uma caneta hidrofóbica para criar um limite hidrofóbico ao redor do slide para evitar que as soluções se derramem do slide. Tome cuidado para não perturbar as células aderentes.
    3. Adicionar solução bloqueadora de albumina sérica bovina (BSA) a 1% (diluída em 1x PBS) à lâmina (~0,5 mL por lâmina). Certifique-se de que a solução está contida dentro do limite hidrofóbico criado na etapa 4.2.4. Incubar a lâmina durante 1 h à temperatura ambiente numa câmara deslizante humidificada.
      NOTA: Embora o bloqueio da BSA não seja necessário para a imunocoloração com faloidina, esta etapa do protocolo permite o acoplamento com a coloração de anticorpos de fluorescência.
    4. Após bloqueio durante 1 h, deitar a solução bloqueadora da lâmina, adicionar o anticorpo faloidina (diluído a 1:200 em solução de bloqueio de BSA a 1%, adicionando 5 μL do anticorpo a 995 μL de solução de BSA) à lâmina e incubar a 4 °C durante a noite. Novamente, certifique-se de que a solução está contida dentro do limite hidrofóbico criado na etapa 4.2.4. Dado que o anticorpo faloidina é conjugado ao corante Alexa Fluor-488, minimize a exposição à luz do reagente do anticorpo antes e depois de adicionar à lâmina.
    5. No dia seguinte, coloque o slide em um suporte de slide protegido contra a exposição à luz (por exemplo, envolva o suporte de slide em papel alumínio ou use um suporte de slide não transparente). Lave as células no suporte da lâmina com 1x PBS por 10 min à temperatura ambiente. Repita a lavagem para um total de três lavagens de 10 minutos.
    6. Adicionar o meio de montagem contendo 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e montar as lâminas com tampas de vidro. Fotografe as células que migraram usando um microscópio de fluorescência padrão.

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Representative Results

Efeitos dos psicanalistas sobre a capacidade migratória de mioblastos murinos
Este ensaio foi aplicado pela primeira vez para avaliar o impacto dos psicanalistas na capacidade migratória dos mioblastos. A Figura 1 descreve o modelo esquemático do ensaio. Para testar esse impacto, ensaios de arranhões foram realizados com mioblastos que foram cultivados isoladamente (sem inserções NCC) em comparação com aqueles cultivados na presença de inserções. Como controle positivo, 500 ng/mL de Wnt5a recombinante (rWnt5a) foram adicionados aos poços de câmara com inserções NCC. Esta concentração de rWnt5a foi determinada por uma análise dose-resposta realizada em células C2C12 (Figura Suplementar S1). Imagens representativas das inserções NCC são mostradas na Figura Suplementar S2, demonstrando que os NCCs estão saudáveis neste momento. A imunofluorescência demonstra uma derrubada robusta de Wnt5a ao nível de proteína após incubação com 50 nM de siRNA Wnt5a (Figura Suplementar S3). Após um período de migração de 9 h, verificou-se que a presença de NCCs aumentou significativamente a capacidade migratória dos mioblastos em comparação com os mioblastos ensaiados na ausência de inserções NCC (72,6% área repovoada por ferida versus 59,1% área repovoada por ferida, p = 0,033). A adição de rWnt5a aos poços de cocultura acelerou a migração mioblástica, com algumas áreas da ferida demonstrando recuperação completa até o ponto de tempo de 9 h, como mostra a Figura 2. Como esperado, os mioblastos migratórios nas três condições apresentaram morfologia celular migratória normal, incluindo filopodos e lamelópodes bem formados e salientes e polarização assimétrica das projeções citoesqueléticas da actina (Figura 2C).

Importância do Wnt5a derivado de NCC para a migração polarizada de mioblastos
Para avaliar o efeito parácrino do Wnt5a derivado do NCC na migração de mioblastos, ensaios de cicatrização de feridas foram realizados em mioblastos após o knockdown mediado por siRNA do Wnt5a em NCCs. Primeiro, a eficiência de knockdown do Wnt5a foi validada em NCCs por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real. Verificou-se que o tratamento com siRNA de 50 nM contra Wnt5a reduziu a expressão gênica de Wnt5a em 64% em comparação com o siRNA de controle negativo (embaralhado) (Figura 3A). Usando essa concentração, as inserções de células de O9-1 foram transfectadas com siRNA controle ou siRNA Wnt5a 48 h antes da montagem da cocultura. As células C2C12 foram cultivadas em condições normais e as feridas foram criadas na confluência apropriada. Imediatamente após a geração da ferida, o controle negativo ou as inserções NCC knockdown Wnt5a foram adicionadas a cada poço. Após um período de migração de 10 h, verificou-se que a derrubada de Wnt5a em psicanalistas reduziu significativamente a capacidade migratória subjacente de mioblastos em comparação com mioblastos ensaiados com psics controle (39,1% área repovoada por ferida versus 74,8% área repovoada por ferida, p < 0,001). Além disso, os mioblastos ensaiados na presença de psicanalistas com knockdown de Wnt5a apresentaram morfologia citológica anormal por imunocoloração, incluindo áreas citoplasmáticas reduzidas e menos projeções citoesqueléticas de actina (Figura 3D). Para resgatar a migração mioblástica, a suplementação exógena de 500 ng/mL de rWnt5a foi adicionada a poços de cocultura contendo pastilhas knockdown Wnt5a. A adição de rWnt5a exógeno foi encontrada para resgatar completamente os defeitos migratórios e morfológicos observados nesses mioblastos (Figura 3C,D).

Sinalização Wnt5a através de ROR2 em mioblastos como um condutor de migração polarizada
Para melhor compreensão dos mecanismos celulares receptores de sinal neste modelo parácrino, o ensaio foi repetido após a derrubada do receptor ROR2 em mioblastos. Neste experimento, os mioblastos foram transfectados com 50 nM de siRNA ROR2 ~40 h antes da geração da ferida, o que se mostrou suficiente para derrubar a expressão gênica de ROR2 em 54% (Figura 4A). Durante este tempo, as inserções NCC foram cultivadas em paralelo em condições normais. Após os mioblastos atingirem a confluência adequada, foram realizados ensaios de arranhões e montadas inserções de poços de cocultura. Após um período de migração de 10 h na presença de inserções NCC, os mioblastos knockdown ROR2 demonstraram capacidade migratória reduzida em comparação com mioblastos tratados com siRNA de controle negativo (48,1% área repovoada por ferida versus 75,7% área repovoada por ferida, p = 0,019) (Figura 4B,C). A adição de 500 ng/mL rWnt5a não conseguiu resgatar a capacidade migratória dos mioblastos após o knockdown do ROR2, sugerindo que a depleção do ROR2 interrompe a capacidade dos mioblastos de receber sinais Wnt5a (Figura 4B,C). A imunomarcação para faloidina corroborou os dados migratórios e mostrou que uma redução nos lamelópodes e filopodos positivos para faloidina nos mioblastos knockdown ROR2 não foi restaurada pela rWnt5a suplementar (Figura 4D).

Figure 1
Figura 1: Modelo esquemático do ensaio. A etapa 1 inclui a expansão in vitro de mioblastos C2C12 e NCCs usando células alimentadoras STO. A etapa 2 envolve o revestimento de NCCs e células C2C12 no sistema de cocultura. A etapa 3 inclui o ensaio da ferida realizado em células C2C12 subjacentes para avaliar a capacidade migratória celular. A etapa 4 envolve a imunomarcação da faloidina para avaliar a arquitetura citológica e a morfologia das células migradas. Abreviaturas: NCCs = células da crista neural; Ab = anticorpo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: A presença de células da crista neural aumenta a capacidade migratória dos mioblastos. (A) A presença de inserções de células da crista neural (NCC) no momento da geração da ferida leva a uma melhor migração mioblástica. A adição do recombinante exógeno Wnt5a (rWnt5a) às coculturas NCC-C2C12 tem o efeito positivo mais forte na migração de mioblastos. (B) Quantificação da área média de mioblastos repovoada às 9 h após a geração da ferida (as barras de erro mostram desvio padrão). (C) Coloração de faloidina de mioblastos na borda da ferida 9 h após a geração da ferida. Retângulos tracejados mostram mioblastos corados com faloidina na frente migratória. Um total de n = 3 amostras foram utilizadas para cada condição experimental quantificada em B. Barras de escala = 200 μm (para A e C). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Wnt5a derivado da crista neural é necessária para a migração de mioblastos. (A) Expressão relativa de mRNA de Wnt5a para validar knockdown mediado por siRNA em NCCs. (B) A migração de mioblastos C2C12 é significativamente reduzida após o knockdown de Wnt5a em NCCs. A adição de rWnt5a exógeno é suficiente para resgatar esse déficit migratório em mioblastos. (C) Quantificação da área média repovoada por mioblastos às 10 h após a geração da ferida (as barras de erro mostram desvio padrão). (D) Coloração de faloidina dos mioblastos na borda da ferida 10 h após a geração da ferida. Retângulos tracejados mostram mioblastos corados com faloidina na frente migratória. Um total de n = 3 amostras foram utilizadas para cada condição experimental quantificada em C. Barras de escala = 200 μm (para B e D). Abreviaturas: NCCs = células da crista neural; siRNA = pequeno RNA interferente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Sinais Wnt5a através de receptores ROR2 em mioblastos para impulsionar a migração. (A) Expressão relativa de mRNA de ROR2 para validar knockdown mediado por siRNA em células C2C12. (B) A derrubada de ROR2 em mioblastos reduz sua capacidade migratória, apesar da presença de NCCs. O rWnt5a exógeno não consegue resgatar a migração de mioblastos após o knockdown de ROR2. (C) Quantificação da área média repovoada por mioblastos às 10 h após a geração da ferida (as barras de erro mostram desvio padrão). (D) Coloração de faloidina dos mioblastos na borda da ferida 10 h após a geração da ferida. Retângulos tracejados mostram mioblastos corados com faloidina na frente migratória. Um total de n = 3 amostras foram utilizadas para cada condição experimental quantificada em C. Barras de escala = 200 μm. Abreviaturas: NCCs = células da crista neural; siRNA = pequeno RNA interferente. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar S1: Análise dose-dependente para suplementação recombinante de Wnt5a. A análise dose-dependente para o teste de suplementação recombinante de Wnt5a 0 ng/mL, 100 ng/mL e 500 ng/mL encontrou 500 ng/mL de rWnt5a exógeno como a concentração ideal para impulsionar a migração de mioblastos e alterações citoarquitetônicas de faloidina durante um período migratório de 12 h in vitro. Barras de escala = 200 μm. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S2: Imagens representativas das pastilhas de poços. Imagens de campos brilhantes de inserções de poços contendo células da crista neural O9-1 tratadas com (A) siRNA de controle negativo de 50 nM e (B) siRNA Wnt5a de 50 nM. Barras de escala = 200 μm. Abreviação: siRNA = pequeno RNA interferente. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S3: Imagens representativas da expressão da proteína Wnt5a em células O9-1 após knockdown Wnt5a mediado por siRNA. Coloração por imunofluorescência da proteína Wnt5a em poços de cultura celular contendo células da crista neural O9-1 tratadas com (A) siRNA de controle negativo de 50 nM e (B) siRNA Wnt5a de 50 nM. Barras de escala = 20 μM. Abreviaturas: siRNA = pequeno RNA interferente; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A via de sinalização não canônica Wnt/polaridade celular planar (PCP) é uma via de sinalização celular criticamente importante que tem sido implicada em múltiplos processos de desenvolvimento 24,25 e doença24,26. Durante o desenvolvimento embrionário, a sinalização Wnt não canônica envolve uma rede expansiva de sinais moleculares de células emissoras de sinais que, em última análise, induzem mudanças na morfologia, organização assimétrica e migração direcional em células receptoras de sinal11. Estudos prévios mostraram que as vias específicas do ligante-receptor que impulsionam essa sinalização são diversas, dependentes do contexto e muitas vezes variam entre os tipos celulares12,13,14,15. Devido a essa complexidade molecular, a capacidade de avaliar interações de sinalização Wnt não canônicas parácrinas usando métodos convencionais de recombinação genética in vivo tem sido limitada. Embora os sistemas in vitro tenham sido cada vez mais utilizados como uma abordagem alternativa para estudar fenótipos celulares Wnt não canônicos, os protocolos disponíveis se concentram exclusivamente nos aspectos de recepção de sinal a jusante da via e não modelam suficientemente a natureza intercelular e parácrina desses eventos de sinalização. Portanto, o objetivo do presente estudo foi desenvolver um protocolo para um sistema de cocultura sem contato que recapitula as interações parácrinas de Wnt in vitro. O foco deste protocolo foi modelar dois aspectos característicos da sinalização funcional não canônica de Wnt in vitro, incluindo a organização das proteínas do filamento intracelular e a capacidade migratória polarizada.

Como prova de conceito, este protocolo foi aplicado para estudar mecanismos parácrinos no contexto do desenvolvimento cardíaco. Durante a cardiogênese, eventos de sinalização recíproca entre NCCs cardíacos e células progenitoras de SHF são cruciais para a maturação adequada da via de saída cardíaca (OFT)27,28,29. Trabalhos anteriores mostraram que, durante o desenvolvimento cardíaco de camundongos, a sinalização Wnt/PCP mediada por NCC em células SHF faríngeas é necessária para a incorporação de células progenitoras de SHF no OFT em desenvolvimento e para o alinhamento normal do OFT21. Schleiffarth et al. e outros mostraram que o knockout genético do gene que codifica o ligante Wnt/PCP, Wnt5, demonstrou perturbar a organização das células progenitoras da SHF e a capacidade migratória, resultando em um OFT cardíaco encurtado e desalinhado22,23,30. Com linhagens celulares de NCC (O9-1)31 e mioblastos (C2C12) murinas estabelecidas, este protocolo demonstra que a cocultura com NCCs está associada ao aumento de filopodos citoplasmáticos positivos para faloidina e lamellipodia e melhora a capacidade migratória de mioblastos em um ensaio de cicatrização de feridas. Esses endpoints moleculares e funcionais in vitro baseiam-se em protocolos publicados anteriormente para manipulação NCC31 e modelam de perto as mudanças fenotípicas in vivo descritas em camundongos knockout globais Wnt5a, validando a utilidade desse modelo.

Para determinar a via molecular específica que conduz a sinalização Wnt não canônica entre NCCs e mioblastos, foram realizados experimentos paralelos de knockdown específicos de células para os genes que codificam o ligante candidato, Wnt5a, em NCCs e seu receptor correspondente, ROR2, em mioblastos. Como esperado, a derrubada de moléculas em células emissoras de sinal (Wnt5a em NCCs) e receptoras de sinal (ROR2 em mioblastos) interrompeu independentemente as alterações citoarquitetônicas de actina relacionadas a Wnt/PCP e inibiu a migração de mioblastos. É importante ressaltar que o resgate fenotípico com Wnt5a recombinante só foi observado na condição de knockdown NCC-Wnt5a, que suporta um mecanismo pelo qual o Wnt5a derivado de NCC ativa a sinalização de PCP em mioblastos através de receptores ROR2. Esses resultados são consistentes com dados de estudos genéticos em camundongos que identificam o eixo Wnt5a-ROR2 como um eixo crucial de sinalização Wnt/PCP entre NCCs e células SHF durante o desenvolvimento cardíaco embrionário 3,21. Embora não tenha sido testado experimentalmente neste protocolo, ainda não está claro se o Wnt5a derivado de SHF fornece sinais parácrinos recíprocos para a crista neural através dos receptores ROR2. Esta hipótese poderia ser testada usando este protocolo, repetindo os experimentos com células C2C12 na parte superior e células O9-1 na parte inferior da construção de inserção do poço. Se o Wnt5a derivado de SHF fornecer um sinal parácrino recíproco através do NCC-ROR2, então seria de se esperar que o knockdown do Wnt5a nas células C2C12 inibisse a capacidade migratória e a polimerização da actina das células O9-1 subjacentes.

Existem vários pontos fortes únicos deste protocolo. Em primeiro lugar, trata-se de um sistema de inserção de poços sem contato que incorpora o uso sequencial de ensaios de cicatrização de feridas e técnicas de imunocoloração para avaliar características funcionais e moleculares de Wnt/PCP na mesma população de células receptoras de sinal. Isso não apenas fornece uma abordagem robusta para a fenotipagem não canônica da organização do filamento intracelular induzido por Wnt e as mudanças migratórias polarizadas in vitro, mas também permite avaliações mais granulares dos mecanismos de transdução de sinal. Embora este protocolo forneça prova de princípio em relação às moléculas Wnt5a-ROR2, o modelo também se presta facilmente a avaliar os efeitos de outros ligantes e receptores na via de sinalização Wnt não canônica. Pode-se ainda adaptar o protocolo de imunocoloração para avaliar a expressão de múltiplas proteínas efetoras potenciais a jusante (por exemplo, RhoA, p-JNK, Daam1, Rac1) que demonstraram transduzir sinais Wnt não canônicos in vivo. Além disso, os níveis de proteína dessas várias moléculas efetoras podem ser correlacionados com fenótipos de citoarquitetura migratória ou de actina. Em segundo lugar, a natureza sem contato do sistema de cocultura permite a manipulação independente de moléculas específicas de envio de sinal versus moléculas receptoras de sinal na via Wnt/PCP. Nesses resultados representativos, optou-se por realizar knockdown de siRNA específico para células. No entanto, este protocolo também é passível do uso de inibidores farmacológicos ou linhagens celulares geneticamente modificadas para avaliar vias candidatas a ligantes-receptores para aplicação clínica. Da mesma forma, pode-se realizar experimentos de resgate fenotípicos adicionando compostos moleculares ou farmacológicos ao meio de cocultura, como foi demonstrado com o Wnt5a recombinante. Direcionar esses compostos para resgatar seletivamente desarranjos de envio de sinal versus receptores de sinal valida ainda mais as vias mecanicistas parácrinas de maneiras que não são permitidas usando sistemas de modelo in vivo atuais.

Há muitas etapas críticas deste protocolo. Primeiro, é importante garantir que as células primárias sejam expandidas e mantidas na confluência apropriada ao longo do protocolo. Se os mioblastos C2C12 se proliferarem até 100% de confluência, eles começarão a se fundir e se diferenciar dos mioblastos em miotubos. Assim, essas células devem ser passadas na densidade apropriada conforme descrito. Em segundo lugar, dado que as células alimentadoras STO são necessárias para gerar meio condicionado para cultivar células O9-1, é imperativo que se inative adequadamente as células STO com mitomicina C e produza suficiente (pelo menos 500 mL) de meio de crescimento O9-1 usando células STO inativadas antes de descongelar e chapear as células O9-1. Talvez o passo mais crítico nesse protocolo seja a geração de arranhões apropriados com geometria e largura uniformes na monocamada do mioblasto32,33. A etapa 3.1.4 detalha várias dicas para otimizar essa parte do protocolo. Apesar dessas recomendações, deve-se reconhecer que a variabilidade associada aos ensaios de arranhões 2D padrão continua sendo um desafio técnico e uma limitação desse protocolo. Portanto, é necessário ter múltiplas replicações técnicas de cada condição experimental.

Finalmente, embora os resultados aqui apresentados tenham sido gerados usando psicanalistas murinos e mioblastos, esse protocolo pode, em princípio, ser adaptado para incluir qualquer célula de envio e recepção de sinal de interesse. Como resultado, este sistema não só tem aplicações para o avanço de mecanismos básicos de sinalização Wnt não canônica parácrina em uma variedade de contextos de desenvolvimento, mas também pode ser usado para testar mecanismos terapêuticos para processos de doenças relacionadas a Wnt / PCP. Exemplos incluem triagem farmacológica para drogas que inibem a capacidade migratória induzida por Wnt/PCP de células malignas ou restauram a migração direcional de tipos de células terminais derivadas de pacientes com capacidade de sinalização PCP defeituosa no início do estudo. Além da via de sinalização Wnt não canônica, este protocolo também pode ser adaptado para estudar outros mecanismos de sinalização parácrina e vias entre dois tipos de células. Por exemplo, o knockdown mediado por siRNA de moléculas secretoras conhecidas em outras vias (por exemplo, Notch, Bmp/Tgf-β, Fgf) em células O9-1 pode ser acoplado à imunocoloração de marcadores proliferativos, de diferenciação ou apoptóticos em mioblastos subjacentes.

Em conclusão, este protocolo estabelece um protocolo experimental novo e altamente tratável para estudar mecanismos de organização de filamentos intracelulares não canônicos relacionados ao Wnt e migração polarizada in vitro. Os métodos aqui descritos melhoram as técnicas existentes, mantendo a natureza intercelular e parácrina das interações Wnt e permitem a avaliação independente dos componentes de envio de sinal versus receptores de sinal dessa via. Este protocolo pode ser amplamente aplicado para investigar mecanismos básicos de sinalização parácrina Wnt/PCP entre dois tipos de células e rastrear novos compostos terapêuticos visando processos de doenças relacionadas ao Wnt/PCP.

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Disclosures

Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que pudessem ser interpretadas como um potencial conflito de interesses.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte pelos prêmios do NIH F30HL154324 para O.T. e K08HL121191 e R03HL154301 para S.R.K. Os autores gostariam de reconhecer que o esquema da Figura 1 deste manuscrito foi criado com biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M-7522
Antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200-10 Stored at 4 °C
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology sc-2323 Stored at 4 °C
C2C12 murine myoblast cell line ATCC CRL-1772
Cell culture flasks, 75 cm2 ThermoFisher Scientific 156499
Chamber Slide System, 4-well ThermoFisher Scientific 154526
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) Corning 10-017-CV Stored at 4 °C
Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-53A
Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane Corning 353095
Fetal bovine serum Fisher Scientific W3381E Stored in 50 mL aliquots at -20 °C
Gelatin solution, 0.1% ATCC PCS-999-027 Stored at 4 °C
Graduated and sterile pipette tips, 10 µL USA Scientific 1111-3810
Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x Gibco 11140-050
Minimum essential medium (MEM) Corning 10-022-CV
Mitomycin C Roche 10107409001
Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm Springside Scientific HRTCG2455
O9-1 neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
Opti-MEM I, 1x Gibco 31985-070
Paraformaldehyde solution in PBS, 4% Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Stored at 4 °C
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) Fisher Scientific W3470H Stored in 10 mL aliquots at -20 °C
Phalloidin-iFluor 488 Abcam ab176753 Stored at -20 °C, Keep out of light
Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CV Stored at 4 °C
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Recombinant human/mouse Wnt5a protein R&D Systems 645-WN-010
Sodium pyruvate, 100 mM Gibco 11360-070
Square Petri dish with grid Thomas Scientific 1219C98
STO murine fibroblast feeder cells ATCC CRL-1503
Triton X-100 solution Sigma Aldrich X100-100ML
Trypsin-EDTA, 0.25% Fisher Scientific W3513C Stored at 4 °C
Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope Carl Zeiss AG
Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope Carl Zeiss AG
Zen lite 2012 microscopy software Carl Zeiss AG imaging software

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Biologia do Desenvolvimento Edição 178
Modelagem de sinalização Wnt não canônica parácrina <em>in vitro</em>
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Toubat, O., Choi, J., Kumar, S. R.… More

Toubat, O., Choi, J., Kumar, S. R. Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. Exp. (178), e63247, doi:10.3791/63247 (2021).

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