Summary

Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwege in vitro

Published: December 10, 2021
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Summary

Die vorliegende Studie skizziert eine hochgradig reproduzierbare und handhabbare Methode, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalereignisse in vitro zu untersuchen. Dieses Protokoll wurde angewendet, um die Auswirkungen der parakrinen Wnt5a-Signalübertragung in murinen Neuralleistenzellen und Myoblasten zu bewerten.

Abstract

Der nichtkanonische Wnt-Signalweg reguliert die intrazelluläre Aktinfilamentorganisation und die polarisierte Migration von Vorläuferzellen während der Embryogenese. Dieser Prozess erfordert komplexe und koordinierte parakrine Interaktionen zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen. Da diese Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Zelltypen unterschiedlicher Linien auftreten können, kann die In-vivo-Bewertung zellspezifischer Defekte eine Herausforderung darstellen. Die vorliegende Studie beschreibt eine hochreproduzierbare Methode zur Bewertung der parakrinen nichtkanonischen Wnt-Signalgebung in vitro. Dieses Protokoll wurde mit der Fähigkeit entwickelt, (1) funktionelle und molekulare Bewertungen der nicht-kanonischen Wnt-Signalübertragung zwischen zwei beliebigen Zelltypen von Interesse durchzuführen; (2) die Rolle von signalsendenden versus signalempfangenden Molekülen im nicht-kanonischen Wnt-Signalweg analysieren; und (3) phänotypische Rettungsexperimente mit molekularen oder pharmakologischen Standardansätzen durchführen.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um die nicht-kanonische Wnt-Signalisierung in Myoblasten zu bewerten. Das Vorhandensein von NCCs ist mit einer erhöhten Anzahl von Phalloidin-positiven zytoplasmatischen Filopodien und Lamellipodien in Myoblasten und einer verbesserten Myoblastenmigration in einem Wundheilungstest verbunden. Die Wnt5a-ROR2-Achse wurde als entscheidender nichtkanonischer Wnt-Signalweg zwischen NCC- und Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen des zweiten Herzfelds (SHF) identifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dies ein sehr gut handhabbares Protokoll ist, um parakrine nichtkanonische Wnt-Signalmechanismen in vitro zu untersuchen.

Introduction

Der nichtkanonische Wnt-Signalweg ist ein evolutionär konservierter Signalweg, der die zelluläre Filamentorganisation und die gerichtete Migration reguliert. Dieser Signalweg wurde an mehreren biologischen Prozessen beteiligt, einschließlich der embryonalen Gewebemorphogenese 1,2,3, der lymphatischen und vaskulären Angiogenese4,5,6,7 und des Krebswachstums und der Metastasierung 8,9,10 . Auf zellulärer Ebene wird die nichtkanonische Wnt-Signalisierung durch koordinierte parakrine Interaktionen zwischen signalsendenden und signalempfangenden Zellen durchgeführt. Diese Wechselwirkungen treten häufig zwischen Zellen verschiedener Linien oder Typen auf und umfassen ein vielfältiges molekulares Netzwerk, das bis zu 19 Liganden und mehrere Rezeptoren, Co-Rezeptoren und nachgeschaltete Signaltransduktionseffektoren umfasst11. Frühere Studien haben gezeigt, dass Liganden-Rezeptor-Kombinationen kontext- und gewebeabhängig variieren können 12,13 und dass dieselben Quellliganden, die die nichtkanonische Wnt-Signalisierung in signalempfangenden Zellen antreiben, von mehreren signalsendenden Zelltypen produziert werden können 14,15 . Angesichts der zellulären und molekularen Komplexität, die mit der nichtkanonischen Wnt-Signalgebung verbunden ist, war die Fähigkeit, individuelle und klinisch relevante Mechanismen in vivo zu untersuchen, begrenzt.

Es wurden Versuche unternommen, die nicht-kanonische Wnt-Signalisierung mit Zellkulturtechniken in vitro zu untersuchen. Zum Beispiel wurden Wundheilungsassays, die in zellulären Monoschichten durchgeführt wurden, verwendet, um die zelluläre gerichtete Migration funktionell zu beurteilen 4,16,17,18,19. Immunfärbungstechniken wurden verwendet, um räumliche Analysen der Oberflächenproteinexpression durchzuführen, um nicht-kanonische Wnt-induzierte Veränderungen in der zellulären Morphologie 7,10, Architektur und asymmetrischen Polarisation18,19,20 zu bewerten. Obwohl diese Ansätze wichtige Werkzeuge zur Charakterisierung von Wnt-bezogenen Phänotypen in Signalempfangszellen geliefert haben, schränkt das Fehlen von signalsendenden Komponenten in diesen Protokollen ihre Fähigkeit ein, parakrine Signalmechanismen, die in vivo beobachtet wurden, genau zu modellieren. Daher besteht nach wie vor ein dringender Bedarf an der Entwicklung von In-vitro-Systemen, die eine robuste und reproduzierbare Bewertung parakriner Signalwechselwirkungen zwischen signalsendenden und empfangenden Zellen des nicht-kanonischen Wnt-Signalwegs, insbesondere zwischen Zellen verschiedener Zelltypen, ermöglichen.

Zu diesem Zweck war das primäre Ziel dieser Studie, ein Protokoll zur Modellierung parakriner nichtkanonischer Wnt-Signalwechselwirkungen in vitro zu erstellen. Wir entwickelten ein berührungsloses Kokultursystem, das signalsendende und signalempfangende Komponenten dieser Interaktionen rekapituliert und die Verwendung molekularer, genetischer oder pharmakologischer Standardansätze ermöglicht, um spezifische Ligandenrezeptormechanismen im nichtkanonischen Wnt-Signalweg unabhängig voneinander zu untersuchen. Mechanismen der NCC-vermittelten Wnt-Signalübertragung wurden in Myoblasten mit etablierten murinen Zelllinien untersucht. Als Beweis des Prinzips wurde dieses Modell verwendet, um Ergebnisse früherer In-vivo-Studien an Mäusen zu bestätigen, die die Wnt5a-ROR2-Achse als relevanten nicht-kanonischen Wnt-Signalweg zwischen NCCs21 und SHF-Kardiomyoblasten-Vorläuferzellen 3,22,23 implizieren.

Protocol

1. Präexperimentelle Expansion und Passaging von Zellen C2C12-Zellkultur:Bereiten Sie 500 ml C2C12-Kulturmedium vor, indem Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle’s Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin kombinieren. Eine Durchstechflasche mit C2C12-Zellen im 37 °C warmen Wasserbad auftauen. Während die C2C12-Zellen auftauen, fügen Sie 5 ml C2C12-Medium zu einem 15-ml-konischen Röhrchen hinzu. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen sof…

Representative Results

Auswirkungen von NCCs auf die Migrationsfähigkeit von murinen MyoblastenDieser Assay wurde zuerst angewendet, um den Einfluss von NCCs auf die Migrationskapazität von Myoblasten zu bewerten. Abbildung 1 zeigt das schematische Modell des Assays. Um diese Wirkung zu testen, wurden Kratztests mit Myoblasten durchgeführt, die isoliert (ohne NCC-Einsätze) im Vergleich zu denen in Gegenwart von Einsätzen gezüchtet wurden. Als Positivkontrolle wurden 500 ng/mL rekombinant…

Discussion

Der nichtkanonische Wnt/Planarzellpolaritäts-Signalweg (PCP) ist ein kritisch wichtiger zellulärer Signalweg, der an multiplen Entwicklungsprozessen 24,25 und Krankheitsprozessen 24,26 beteiligt ist. Während der embryonalen Entwicklung beinhaltet die nichtkanonische Wnt-Signalübertragung ein ausgedehntes Netzwerk molekularer Signale von signalsendenden Zellen, die letztendlich Veränderungen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH-Auszeichnungen F30HL154324 an O.T. und K08HL121191 und R03HL154301 an S.R.K. unterstützt. Die Autoren möchten anerkennen, dass das Schema in Abbildung 1 in diesem Manuskript mit biorender.com erstellt wurde.

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma Aldrich M-7522
Antifade mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200-10 Stored at 4 °C
Bovine serum albumin Santa Cruz Biotechnology sc-2323 Stored at 4 °C
C2C12 murine myoblast cell line ATCC CRL-1772
Cell culture flasks, 75 cm2 ThermoFisher Scientific 156499
Chamber Slide System, 4-well ThermoFisher Scientific 154526
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) Corning 10-017-CV Stored at 4 °C
Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL Fisher Scientific 14-959-53A
Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane Corning 353095
Fetal bovine serum Fisher Scientific W3381E Stored in 50 mL aliquots at -20 °C
Gelatin solution, 0.1% ATCC PCS-999-027 Stored at 4 °C
Graduated and sterile pipette tips, 10 µL USA Scientific 1111-3810
Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL Millipore Sigma ESG1106
L-glutamine 200 mM (100x) Gibco 25030-081
Lipofectamine RNAiMAX Thermo Fisher Scientific 13778-075
MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x Gibco 11140-050
Minimum essential medium (MEM) Corning 10-022-CV
Mitomycin C Roche 10107409001
Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm Springside Scientific HRTCG2455
O9-1 neural crest cell line Millipore Sigma SCC049
Opti-MEM I, 1x Gibco 31985-070
Paraformaldehyde solution in PBS, 4% Santa Cruz Biotechnology sc-281692 Stored at 4 °C
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) Fisher Scientific W3470H Stored in 10 mL aliquots at -20 °C
Phalloidin-iFluor 488 Abcam ab176753 Stored at -20 °C, Keep out of light
Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 Corning 21-040-CV Stored at 4 °C
Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) R&D Systems 233-FB-025
Recombinant human/mouse Wnt5a protein R&D Systems 645-WN-010
Sodium pyruvate, 100 mM Gibco 11360-070
Square Petri dish with grid Thomas Scientific 1219C98
STO murine fibroblast feeder cells ATCC CRL-1503
Triton X-100 solution Sigma Aldrich X100-100ML
Trypsin-EDTA, 0.25% Fisher Scientific W3513C Stored at 4 °C
Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope Carl Zeiss AG
Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope Carl Zeiss AG
Zen lite 2012 microscopy software Carl Zeiss AG imaging software

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Cite This Article
Toubat, O., Choi, J., Kumar, S. R. Modeling Paracrine Noncanonical Wnt Signaling In Vitro. J. Vis. Exp. (178), e63247, doi:10.3791/63247 (2021).

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