in vitroでのパラクリン非標準Wntシグナル伝達のモデリング
Summary
本研究では、パラクリンの非標準的なWntシグナル伝達イベントを in vitroで 研究するための再現性が高く扱いやすい方法を概説しています。このプロトコルは、マウス神経堤細胞および筋芽細胞におけるパラクリンWnt5aシグナル伝達の影響を評価するために適用されました。
Abstract
非標準的なWntシグナル伝達は、胚形成中の細胞内アクチンフィラメント組織および前駆細胞の分極した遊走を調節する。このプロセスには、シグナル伝達細胞とシグナル受信細胞の間の複雑で協調的なパラクリン相互作用が必要です。これらの相互作用が異なる系統のさまざまな種類の細胞間で発生する可能性があることを考えると、細胞特異的欠陥の in vivo 評価は困難な場合があります。本研究では、 in vitro でパラクリン非標準的なWntシグナル伝達を評価するための再現性の高い方法について説明します。このプロトコルは、(1)関心のある任意の2つの細胞型間で非標準的なWntシグナル伝達の機能的および分子的評価を実施する能力を備えて設計されました。(2)非標準的なWntシグナル伝達経路におけるシグナル伝達分子とシグナル受信分子の役割を分析する。(3)標準的な分子学的または薬理学的アプローチで表現型レスキュー実験を実施する。
このプロトコルは、筋芽細胞における神経堤細胞(NCC)を介した非標準的なWntシグナル伝達を評価するために使用されました。NCCの存在は、筋芽細胞におけるファロイジン陽性細胞質糸状足および層状突起の数の増加、ならびに創傷治癒アッセイにおける筋芽細胞遊走の改善と関連している。 Wnt5a-ROR2 軸は、NCCと第二心野(SHF)心筋芽細胞前駆細胞との間の重要な非標準的なWntシグナル伝達経路として同定されました。結論として、これはin vitroでパラクリン非標準的なWntシグナル伝達メカニズムを研究するための非常に扱いやすいプロトコルです。
Introduction
非標準的なWntシグナル伝達は、細胞フィラメントの構成と方向性の移動を調節する進化的に保存された経路です。この経路は、胚組織形態形成1,2,3、リンパおよび血管血管新生4,5,6,7、および癌の成長および転移8,9,10を含む複数の生物学的プロセスに関与しています。.細胞レベルでは、非標準的なWntシグナル伝達は、シグナル伝達細胞とシグナル受信細胞の間の協調的なパラクリン相互作用を介して行われます。これらの相互作用は、異なる系統またはタイプの細胞間で頻繁に起こり、最大19個のリガンドおよび複数の受容体、共受容体、および下流のシグナル伝達エフェクターを含む多様な分子ネットワークを含む11。このシグナル伝達プロセスをさらに複雑にしているのは、リガンドと受容体の組み合わせが状況依存的および組織依存的に変化する可能性があることが以前の研究で示されている12,13、およびシグナル受信細胞で非標準的なWntシグナル伝達を駆動する同じソースリガンドが複数のシグナル送信細胞タイプによって生成される可能性があることが示されています14,15。.非標準的なWntシグナル伝達に関連する細胞および分子の複雑さを考えると、in vivoで個々の臨床的に関連するメカニズムを研究する能力は限られています。
インビトロでの細胞培養技術を用いて非標準的なWntシグナル伝達を研究する試みがなされている。例えば、細胞単層で実施される創傷治癒アッセイは、細胞指向性移動を機能的に評価するために使用されてきた4、16、17、18、19。免疫染色技術は、細胞形態7,10、構造、および非対称分極における非標準的なWnt誘発変化を評価するために、表面タンパク質発現の空間解析を実行するために使用されています7,10,および非対称分極18,19,20。 これらのアプローチは、シグナル受信細胞におけるWnt関連の表現型を特徴付けるための重要なツールを提供してきましたが、これらのプロトコルにシグナル送信コンポーネントがないため、in vivoで観察されるパラクリンシグナル伝達メカニズムを正確にモデル化する能力が制限されています。その結果、非標準的なWnt経路のシグナル送信細胞と受信細胞、特に異なる細胞タイプの細胞間のパラクリンシグナル伝達相互作用の堅牢で再現性のある評価を可能にするin vitroシステムを開発することが依然として重要です。
この目的のために、この研究の主な目的は、in vitroでパラクリン非標準的なWntシグナル伝達相互作用をモデル化するためのプロトコルを確立することでした。私たちは、これらの相互作用のシグナル送信およびシグナル受信成分を再現し、標準的な分子、遺伝、または薬理学的アプローチを使用して、非標準的なWnt経路における特定のリガンド受容体メカニズムを独立して研究できる非接触共培養システムを開発しました。NCCを介したWntシグナル伝達のメカニズムを、確立されたマウス細胞株を用いて筋芽細胞で調べました。原理の証明として、このモデルは、NCCs21とSHF心筋芽細胞前駆細胞との間の関連する非標準的なWntシグナル伝達経路としてWnt5a-ROR2軸を関与させるマウスにおける以前のin vivo研究の所見を裏付けるために使用された3,22,23。
Protocol
Representative Results
Discussion
非標準的なWnt/平面細胞極性(PCP)シグナル伝達経路は、複数の発生24,25および疾患プロセス24,26に関与している非常に重要な細胞シグナル伝達経路です。胚発生中、非標準的なWntシグナル伝達は、シグナル伝達細胞からの分子シグナルの広範なネットワークを含み、最終的にはシグナル受信細胞にお?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究の一部は、NIHがO.T.にF30HL154324を、S.R.K.にK08HL121191およびR03HL154301を授与したことによって支援されました。著者らは、この原稿の 図1 の回路図が biorender.com で作成されたことを認めたいと思います。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M-7522 | |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | Stored at 4 °C |
| Bovine serum albumin | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323 | Stored at 4 °C |
| C2C12 murine myoblast cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Cell culture flasks, 75 cm2 | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| Chamber Slide System, 4-well | ThermoFisher Scientific | 154526 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), high glucose (4.5 g/L), L-glutamine (2 mM) | Corning | 10-017-CV | Stored at 4 °C |
| Falcon conical centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Falcon permeable support for 24-well plate with 0.4 µM transparent PET membrane | Corning | 353095 | |
| Fetal bovine serum | Fisher Scientific | W3381E | Stored in 50 mL aliquots at -20 °C |
| Gelatin solution, 0.1% | ATCC | PCS-999-027 | Stored at 4 °C |
| Graduated and sterile pipette tips, 10 µL | USA Scientific | 1111-3810 | |
| Leukemia inhibitory factor (LIF), 106 unit/mL | Millipore Sigma | ESG1106 | |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Thermo Fisher Scientific | 13778-075 | |
| MEM non-essential amino acids (MEM NEAA) 100x | Gibco | 11140-050 | |
| Minimum essential medium (MEM) | Corning | 10-022-CV | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Non-stick auto-glass coverslips, 24 x 55 mm | Springside Scientific | HRTCG2455 | |
| O9-1 neural crest cell line | Millipore Sigma | SCC049 | |
| Opti-MEM I, 1x | Gibco | 31985-070 | |
| Paraformaldehyde solution in PBS, 4% | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Stored at 4 °C |
| Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL penicillin and 10,000 μg/mL streptomycin) | Fisher Scientific | W3470H | Stored in 10 mL aliquots at -20 °C |
| Phalloidin-iFluor 488 | Abcam | ab176753 | Stored at -20 °C, Keep out of light |
| Phosphate-buffer saline (PBS), 1x, without calcium and magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CV | Stored at 4 °C |
| Recombinant human fibroblast growth factor-basic (rhFGF-basic) | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Recombinant human/mouse Wnt5a protein | R&D Systems | 645-WN-010 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Gibco | 11360-070 | |
| Square Petri dish with grid | Thomas Scientific | 1219C98 | |
| STO murine fibroblast feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Triton X-100 solution | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Fisher Scientific | W3513C | Stored at 4 °C |
| Zeiss Apotome.2 fluoresence microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss inverted Axio Vert.A1 light microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zen lite 2012 microscopy software | Carl Zeiss AG | imaging software |
References
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