Technique modifiée pour l’utilisation de cœurs murins néonatals dans la préparation de Langendorff

Summary

Le présent protocole décrit la canulation aortique et la perfusion rétrograde du cœur murin néonatal ex-vivo . Une stratégie à deux personnes, utilisant un microscope à dissection et une aiguille de petit calibre émoussée, permet une canulation fiable. La quantification de la tension contractile longitudinale est réalisée à l’aide d’un capteur de force relié à l’apex du ventricule gauche.

Abstract

L’utilisation du cœur perfusé rétrograde ex-vivo a longtemps été une pierre angulaire de l’étude de l’ischémie-reperfusion depuis son développement par Oskar Langendorff il y a plus d’un siècle. Bien que cette technique ait été appliquée à des souris au cours des 25 dernières années, son utilisation chez cette espèce a été limitée aux animaux adultes. La mise au point d’une méthode efficace pour canuler de manière cohérente l’aorte murine néonatale permettrait l’étude systématique du cœur perfusé rétrograde isolé pendant une période critique de développement cardiaque chez une espèce génétiquement modifiable et peu coûteuse. La modification de la préparation de Langendorff permet la canulation et l’établissement d’une reperfusion dans le cœur murin néonatal tout en minimisant le temps ischémique. L’optimisation nécessite une technique à deux personnes pour permettre une canulation réussie de l’aorte de la souris nouveau-née à l’aide d’un microscope à dissection et d’une aiguille modifiée disponible dans le commerce. L’utilisation de cette approche établira de manière fiable une perfusion rétrograde en 3 minutes. Parce que la fragilité du cœur néonatal de la souris et de la taille de la cavité ventriculaire empêche la mesure directe de la pression intraventriculaire générée à l’aide d’un ballonnet, l’utilisation d’un transducteur de force relié par une suture à l’apex du ventricule gauche pour quantifier la tension contractile longitudinale est nécessaire. Cette méthode permet aux chercheurs d’établir avec succès une préparation isolée du cœur murin néonatal à flux rétrograde et perfusé, permettant l’étude de la biologie cardiaque du développement de manière ex vivo . Il est important de noter que ce modèle sera un outil puissant pour étudier les réponses physiologiques et pharmacologiques à l’ischémie-reperfusion dans le cœur néonatal.

Introduction

Les préparations cardiaques ex vivo sont un aliment de base des études physiologiques, physiopathologiques et pharmacologiques depuis plus d’un siècle. Issu des travaux d’Elias Cyon dans les années 1860, Oskar Langendorff a adapté le modèle de grenouille isolée pour la perfusion rétrograde, pressurisant la racine aortique pour fournir un flux coronaire avec un perfusat oxygéné¹. En utilisant son adaptation, Langendorff a pu démontrer une corrélation entre la circulation coronaire et la fonction mécanique². Le cœur perfusé rétrograde ex-vivo, plus tard surnommé la technique de Langendorff, est resté une pierre angulaire de l’investigation physiologique, tirant parti de sa simplicité pour étudier puissamment le cœur isolé en l’absence de facteurs de confusion potentiels. La préparation de Langendorff a été encore modifiée pour permettre au cœur de s’éjecter (le soi-disant « cœur de travail ») et permettre au perfusat de recirculer³. Cependant, les principaux critères physiologiques d’intérêt sont restés inchangés. Ces critères d’évaluation comprennent des mesures de la fonction contractile, de la conduction électrique, du métabolisme cardiaque et de la résistance coronarienne⁴.

Pour évaluer la fonction cardiaque dans sa préparation originale de cœur de grenouille, Langendorff a mesuré la tension générée par la contraction ventriculaire dans l’axe longitudinal à l’aide d’une suture reliée entre l’apex du cœur et un transducteur de force. ⁵ La contraction isométrique a été quantifiée de cette manière avec une tension basale appliquée au cœur en l’absence de remplissage ventriculaire. Le raffinement de l’approche a conduit à des ballons remplis de liquide placés dans le ventricule gauche via l’oreillette gauche pour évaluer les performances myocardiques pendant la contraction isovolumique⁶. Pour évaluer le rythme cardiaque et la fréquence cardiaque, des sondes de surface peuvent être placées sur les pôles du cœur pour permettre aux chercheurs d’enregistrer l’électrocardiogramme. Cependant, on peut s’attendre à une bradycardie relative, compte tenu de la dénervation obligatoire. La stimulation extrinsèque peut servir à surmonter cela et à éliminer la variabilité de la fréquence cardiaque entre les expériences¹. Une autre mesure de résultat, le métabolisme myocardique, peut être évaluée en mesurant la teneur en oxygène et en substrat métabolique dans le perfusat coronaire et l’effluent et en calculant la différence entre eux⁷. La quantification du lactate dans l’effluent coronaire peut aider à caractériser les périodes de métabolisme anaérobie, comme on le voit avec l’hypoxie, l’hypoperfusion, l’ischémie-reperfusion ou les perturbations métaboliques⁷.

Les travaux originaux de Langendorff ont permis l’étude du cœur de mammifère ex-vivo, en utilisant les chats comme sujet principal⁵. L’évaluation du cœur de rat isolé a gagné en popularité au milieu des années 1900 avec Howard Morgan, qui a détaillé le modèle de rat « cœur de travail » en 1967⁵. L’utilisation de souris a commencé il y a seulement 25 ans en raison de la complexité technique, de la fragilité des tissus et de la taille relativement petite du cœur murin. Malgré les défis associés à l’étude des souris, les coûts plus faibles et la facilité de la manipulation génétique ont augmenté l’attrait et la demande de telles préparations murines ex-vivo. Malheureusement, l’application de la technique a été limitée aux animaux adultes, les souris juvéniles de 4 semaines étant les sujets les plus jeunes utilisés pour l’étude ex vivo jusqu’à tout récemment ^8,9. Bien que les souris juvéniles soient « relativement immatures » par rapport aux adultes, leur utilité en tant que sujets pour les études de biologie du développement est limitée car elles ont, dans l’ensemble, été sevrées de leur mère de naissance et commenceront bientôt la puberté¹⁰. L’adolescence se produit bien au-delà de la transition postnatale dans l’utilisation du substrat myocardique du glucose et du lactate aux acides gras¹¹. Ainsi, la plupart des informations sur les changements métaboliques dans le cœur néonatal ont historiquement résulté de travaux ex vivo chez des espèces plus grandes telles que les lapins et les cochons d’Inde¹¹.

En effet, il existe des approches alternatives à la préparation de Langendorff. Il s’agit notamment de l’expérimentation in vitro, qui manque de l’ensemble des données fonctionnelles et du contexte de l’organe, ou des études in vivo. Cela peut être techniquement difficile et compliqué par des variables confondantes telles que les effets cardiovasculaires et respiratoires d’un agent anesthésique requis, l’influence de l’apport neurohumoral, les conséquences de la température centrale, l’état nutritionnel de l’animal et la disponibilité du substrat^12,13. Parce que l’approche de Langendorff permet d’étudier le cœur isolé-perfusé de manière ex-vivo d’une manière plus contrôlée en l’absence de tels facteurs de confusion, elle a été et continue d’être considérée comme un puissant outil expérimental. Par conséquent, la technique présentée ici donne aux chercheurs une approche expérimentale pour l’étude ex vivo du cœur murin nouveau-né et limite le temps de reperfusion.

L’étude du cœur pendant les périodes de développement est une considération importante compte tenu de la vaste gamme de transitions biochimiques, physiologiques et anatomiques qui se produisent pendant la maturation du myocarde. Les changements du métabolisme anaérobie à la phosphorylation oxydative, les changements dans l’utilisation du substrat et la progression de la prolifération cellulaire à l’hypertrophie sont des processus dynamiques qui se produisent uniquement dans le cœur immature^11,14. Un autre aspect critique du développement cardiaque est que les facteurs de stress rencontrés pendant les périodes nécessaires peuvent produire des réponses accrues dans le cœur du nouveau-né et modifier la susceptibilité future aux insultes à l’âge adulte¹⁵. Bien que des travaux antérieurs aient utilisé des rats, des agneaux et des lapins nouveau-nés pour étudier le cœur néonatal perfusé de Langendorff, des progrès permettant l’utilisation de souris sont nécessaires compte tenu de l’importance de cette espèce pour la recherche en biologie du développement¹⁶. Pour répondre à ce besoin, le premier modèle de cœur nouveau-né perfusé de Langendorff murin utilisant des animaux âgés de 10 jours a récemment été établi⁶. Présenté ici est une méthode pour permettre une canulation aortique réussie et établir une perfusion rétrograde du cœur murin du nouveau-né isolé. Cette approche peut être utilisée pour la pharmacologie, l’ischémie-reperfusion ou les études du métabolisme axées sur la fonction de l’organe entier ou peut être adaptée pour l’isolement des cardiomyocytes.

Protocol

Les approbations du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Columbia University Medical Center ont été obtenues pour toutes les méthodes décrites. Des souris mâles de type sauvage C57Bl/6 de jour postnatal 10 ont été utilisées pour l’étude. 1. Préparation de l’appareil Langendorff Pour minimiser la complexité, utilisez du perfusat oxygéné non recirculant dans l’appareil de Langendorff (voir tableau des matériaux</…

Representative Results

Des souris P10 ont été utilisées pour modéliser un point temporel dans la petite enfance humaine26,27. Quinze cœurs de souris nouveau-nés isolés en C57Bl/6 ont été récoltés et canulés avec succès. Les cœurs ont été perfusés avec un flux continu de 2,5 mL min-1 de KHB oxygéné réchauffé. Les paramètres métaboliques, y compris l’extraction du glucose, la consommation d’oxygène, la production de lactate et les paramètres physio…

Discussion

Le présent travail décrit la canulation aortique réussie et la perfusion rétrograde dans le cœur isolé de souris nouveau-né. Fait important, il permet aux chercheurs de surmonter les obstacles que le jeune âge murin et la petite taille du cœur présentaient auparavant⁸. Bien qu’elle ne soit pas complexe dans sa conception, l’approche nécessite un degré important de compétences techniques. Les étapes clés qui mettront inévitablement au défi même les enquêteurs les plus compét…

Materials

Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A