Modifizierte Technik zur Verwendung von neonatalen Murinherzen im Langendorff-Präparat

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aortenkanülierung und die retrograde Perfusion des ex-vivo neonatalen murinen Herzens. Eine Zwei-Personen-Strategie mit einem Seziermikroskop und einer abgestumpften kleinen Messnadel ermöglicht eine zuverlässige Kanülierung. Die Quantifizierung der longitudinalen kontraktilen Spannung erfolgt mit einem Kraftaufnehmer, der mit der Spitze des linken Ventrikels verbunden ist.

Abstract

Die Verwendung des ex-vivo retrograden perfundierten Herzens ist seit seiner Entwicklung durch Oskar Langendorff vor über einem Jahrhundert ein Eckpfeiler der Ischämie-Reperfusionsuntersuchung. Obwohl diese Technik in den letzten 25 Jahren auf Mäuse angewendet wurde, war ihre Verwendung bei dieser Art auf erwachsene Tiere beschränkt. Die Entwicklung einer erfolgreichen Methode zur konsequenten Kanülierung der neonatalen murinen Aorta würde die systematische Untersuchung des isolierten retrograden perfundierten Herzens während einer kritischen Phase der kardialen Entwicklung in einer genetisch veränderbaren und kostengünstigen Spezies ermöglichen. Die Modifikation des Langendorff-Präparats ermöglicht die Kanülierung und Etablierung der Reperfusion im neonatalen murinen Herzen bei gleichzeitiger Minimierung der ischämischen Zeit. Die Optimierung erfordert eine Zwei-Personen-Technik, um eine erfolgreiche Kanülierung der neugeborenen Mausaorta mit einem Seziermikroskop und einer modifizierten handelsüblichen Nadel zu ermöglichen. Die Verwendung dieses Ansatzes wird die retrograde Perfusion innerhalb von 3 Minuten zuverlässig etablieren. Da die Zerbrechlichkeit des neonatalen Mausherzens und der Ventrikelhöhle die direkte Messung des mit einem Ballon erzeugten intraventrikulären Drucks verhindert, ist die Verwendung eines Kraftwandlers erforderlich, der durch eine Naht mit der Spitze des linken Ventrikels verbunden ist, um die kontraktile Längsspannung zu quantifizieren. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, erfolgreich eine isolierte retrograde-perfundierte Neugeborenen-Herzvorbereitung für Neugeborene zu etablieren, die das Studium der Entwicklungskardiologie in einer Ex-vivo-Weise ermöglicht. Wichtig ist, dass dieses Modell ein leistungsfähiges Werkzeug sein wird, um die physiologischen und pharmakologischen Reaktionen auf die Ischämie-Reperfusion im neonatalen Herzen zu untersuchen.

Introduction

Ex-vivo-Herzpräparate sind seit über einem Jahrhundert ein fester Bestandteil physiologischer, pathophysiologischer und pharmakologischer Studien. Ausgehend von der Arbeit von Elias Cyon in den 1860er Jahren passte Oskar Langendorff das isolierte Froschmodell für die retrograde Perfusion an und setzte die Aortenwurzel unter Druck, um den Koronarfluss mit einem sauerstoffhaltigen Perfusat¹ zu gewährleisten. Mit seiner Adaption konnte Langendorff einen Zusammenhang zwischen Koronarzirkulation und mechanischer Funktion² nachweisen. Das ex-vivo retrograde perfundierte Herz, später namensgebend als Langendorff-Technik bezeichnet, ist ein Eckpfeiler der physiologischen Untersuchung geblieben und nutzt seine Einfachheit, um das isolierte Herz in Abwesenheit potenzieller Störfaktoren kraftvoll zu untersuchen. Das Langendorff-Präparat wurde weiter modifiziert, damit das Herz ausstoßen kann (das sogenannte “Arbeitsherz”) und das Perfusat rezirkulieren^{kann 3}. Die primären physiologischen Endpunkte von Interesse sind jedoch unverändert geblieben. Zu diesen Endpunkten gehören Messungen der kontraktilen Funktion, der elektrischen Leitung, des Herzstoffwechsels und des Koronarwiderstands⁴.

Um die Herzfunktion in seiner ursprünglichen Froschherzvorbereitung zu bewerten, maß Langendorff die Spannung, die durch die ventrikuläre Kontraktion in der Längsachse erzeugt wird, mit einer Naht, die zwischen der Herzspitze und einem Kraftaufnehmer verbunden ist. ⁵ Die isometrische Kontraktion wurde auf diese Weise quantifiziert, wobei die Basalspannung in Abwesenheit einer ventrikulären Füllung auf das Herz ausgeübt wurde. Die Verfeinerung des Ansatzes hat dazu geführt, dass flüssigkeitsgefüllte Ballons über den linken Vorhof in den linken Ventrikel platziert wurden, um die Myokardleistung während der isovonomen Kontraktion^{zu bewerten 6}. Um den Herzrhythmus und die Herzfrequenz zu beurteilen, können Oberflächenleitungen an den Polen des Herzens platziert werden, damit die Forscher das Elektrokardiogramm aufzeichnen können. Angesichts der obligatorischen Denervierung ist jedoch mit einer relativen Bradykardie zu rechnen. Extrinsisches Pacing kann dazu dienen, dies zu überwinden und die Herzfrequenzvariabilität zwischen den Experimenten^{zu eliminieren 1}. Ein weiteres Ergebnismaß, der Myokardstoffwechsel, kann beurteilt werden, indem der Sauerstoff- und Stoffwechselsubstratgehalt im Koronarperfusat und -abwasser gemessen und die Differenz zwischen ihnen berechnet^{wird 7}. Die Laktatquantifizierung im Koronarabwasser kann bei der Charakterisierung von Perioden des anaeroben Stoffwechsels helfen, wie sie bei Hypoxie, Hypoperfusion, Ischämie-Reperfusion oder metabolischen Störungen beobachtet^{werden 7}.

Langendorffs ursprüngliche Arbeit ermöglichte die Untersuchung des Ex-vivo-Säugetierherzens unter Verwendung von Katzen als Hauptfach⁵. Die Bewertung des isolierten Rattenherzens gewann Mitte der 1900er Jahre an Popularität bei Howard Morgan, der 1967 das Rattenmodell des “arbeitenden Herzens” detailliert^{beschrieb 5}. Der Einsatz von Mäusen begann erst vor 25 Jahren aufgrund der technischen Komplexität, der Gewebezerbrechlichkeit und der relativ geringen murinen Herzgröße. Trotz der Herausforderungen, die mit der Untersuchung von Mäusen verbunden sind, haben die niedrigeren Kosten und die Leichtigkeit der genetischen Manipulation die Attraktivität und Nachfrage solcher murinen Ex-vivo-Präparate erhöht. Leider war die Anwendung der Technik auf erwachsene Tiere beschränkt, wobei juvenile 4 Wochen alte Mäuse die jüngsten Probanden waren, die bis vor kurzem für Ex-vivo-Studien verwendet wurden ^8,9. Während juvenile Mäuse im Vergleich zu Erwachsenen “relativ unreif” sind, ist ihr Nutzen als Probanden für entwicklungsbiologische Studien begrenzt, da sie im Großen und Ganzen von ihrer Muttermutter entwöhnt wurden und bald in die Pubertät^{kommen werden 10}. Die Adoleszenz tritt weit über den postnatalen Übergang in der myokardialen Substratverwertung von Glukose und Laktat zu Fettsäuren^{hinaus auf 11}. So sind die meisten Informationen über die metabolischen Veränderungen im neonatalen Herzen historisch aus der Ex-vivo-Arbeit bei größeren Arten wie Kaninchen und Meerschweinchen^{entstanden 11}.

Tatsächlich gibt es alternative Ansätze für die Langendorff-Vorbereitung. Dazu gehören In-vitro-Experimente, denen die gesamten funktionellen Daten und der Kontext des Organs fehlen, oder In-vivo-Studien. Dies kann technisch herausfordernd und kompliziert sein, indem Variablen wie die kardiovaskulären und respiratorischen Wirkungen eines erforderlichen Anästhetikums, der Einfluss des neurohumoralen Inputs, die Folgen der Kerntemperatur, der Ernährungszustand des Tieres und die Substratverfügbarkeit^12,13 vermischt werden. Da der Langendorff-Ansatz die Untersuchung des isoliert-perfundierten Herzens in einer Ex-vivo-Weise in einer kontrollierteren Weise in Abwesenheit solcher Störfaktoren ermöglicht, wurde und wird er als ein leistungsfähiges Prüfinstrument angesehen. Daher gibt die hier vorgestellte Technik den Forschern einen experimentellen Ansatz für die Ex-vivo-Studie des neugeborenen murinen Herzens und begrenzt die Zeit bis zur Reperfusion.

Die Untersuchung des Herzens in Entwicklungsphasen ist angesichts der weitreichenden biochemischen, physiologischen und anatomischen Übergänge, die während der Myokardreifung auftreten, eine wichtige Überlegung. Verschiebungen vom anaeroben Stoffwechsel zur oxidativen Phosphorylierung, Veränderungen in der Substratverwertung und Progression von der Zellproliferation zur Hypertrophie sind dynamische Prozesse, die einzigartig im unreifen Herzen auftreten^11,14. Ein weiterer kritischer Aspekt des sich entwickelnden Herzens ist, dass Stressoren, die während der notwendigen Perioden auftreten, erhöhte Reaktionen im neugeborenen Herzen hervorrufen und die zukünftige Anfälligkeit für Beleidigungen im Erwachsenenalter verändern^{können 15}. Obwohl frühere Arbeiten neugeborene Ratten, Lämmer und Kaninchen zur Untersuchung des Langendorff-perfundierten neonatalen Herzens verwendet haben, sind angesichts der Bedeutung dieser Spezies für die entwicklungsbiologische Forschung¹⁶ Fortschritte erforderlich, die die Verwendung von Mäusen ermöglichen. Um diesem Bedürfnis gerecht zu werden, wurde kürzlich das erste murine Langendorff-perfundierte neugeborene Herzmodell mit 10 Tage alten Tieren etabliert⁶. Hier wird eine Methode vorgestellt, um eine erfolgreiche Aortenkanülierung zu ermöglichen und eine retrograde Perfusion des isolierten neugeborenen murinen Herzens zu etablieren. Dieser Ansatz kann für Pharmakologie, Ischämie-Reperfusion oder Stoffwechselstudien verwendet werden, die sich auf die Funktion des gesamten Organs konzentrieren, oder kann für die Isolierung von Kardiomyozyten angepasst werden.

Protocol

Für alle beschriebenen Methoden wurden die Zulassungen des Institutional Animal Care and Use Committee des Columbia University Medical Center eingeholt. Wildtyp C57Bl/6 männliche postnatale Tag 10 Mäuse wurden für die Studie verwendet. 1. Vorbereitung der Langendorff-Apparatur Um die Komplexität zu minimieren, verwenden Sie nicht rezirkulierendes oxygeniertes Perfusat innerhalb der Langendorff-Apparatur (siehe Materialtabelle) über kon…

Representative Results

P10-Mäuse wurden verwendet, um einen Zeitpunkt im menschlichen Säuglingsalter zu modellieren26,27. Fünfzehn isolierte C57Bl/6 neugeborene Mausherzen wurden erfolgreich geerntet und kanüliert. Die Herzen wurden mit einem kontinuierlichen Fluss von 2,5 ml min-1 erwärmtem sauerstoffhaltigem KHB durchblutet. Metabolische Parameter, einschließlich Glukoseextraktion, Sauerstoffverbrauch, Laktatproduktion und physiologische Parameter wie Herzfrequenz, P…

Discussion

Die vorliegende Arbeit beschreibt eine erfolgreiche Aortenkanülierung und retrograde Perfusion im isolierten neugeborenen Mausherzen. Wichtig ist, dass es den Forschern ermöglicht, die Barrieren zu überwinden, die das Alter junger Mäuse und die geringe Herzgröße zuvor⁸ dargestellt haben. Obwohl der Ansatz im Design nicht komplex ist, erfordert er ein erhebliches Maß an technischem Können. Schlüsselschritte, die selbst die technisch versiertesten Ermittler unweigerlich herausfordern werden…

Materials

Rodent Langendorff Apparatus	Radnoti	130102EZ
24 G catheter	BD	381511
26 G needle on 1 mL syringe combo	BD	309597
26 G steel needle	BD	305111
5-0 Silk Suture	Ethicon	S1173
Bio Amp	ADInstruments	FE135
Bio Cable	ADInstruments	MLA1515
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
Circulating heating water Bath	Haake	DC10
curved iris scissor	Medline	MDS10033Z
dissecting microscope	Nikon	SMZ-2B
find spring scissors	Kent	INS600127
Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/D
glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
Heparin	Sagent	400-01
High pressure tubing	Edwards Lifesciences	50P184
iris dressing forceps	Kent	INS650915-4
Jeweler-style curved fine forceps	Miltex	17-307-MLTX
KCl	Sigma-Aldrich	P3911-25G
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662-25G
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506-500G
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888-25G
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-25G
Roller Pump	Gilson	Minipuls 3
straight dissecting scissors	Kent	INS600393-G
Temporary cardiac pacing wire	Ethicon	TPW30
Wide Range Force Transducer	ADInstruments	MLT1030/A