Kvantificering af jerntransport over musemoderkagen In Vivo ved hjælp af ikke-radioaktive jernisotoper
Summary
Denne artikel demonstrerer, hvordan man forbereder og administrerer transferrinbundet ikke-radioaktivt isotopisk jern til undersøgelser af jerntransport i musegraviditet. Fremgangsmåden til kvantificering af isotopisk jern i fetoplacentale rum er også beskrevet.
Abstract
Jern er afgørende for moderens og fostrets sundhed under graviditeten, med ca. 1 g jern, der er nødvendigt hos mennesker for at opretholde en sund graviditet. Føtal jernbegavelse er helt afhængig af jernoverførsel over moderkagen, og forstyrrelser af denne overførsel kan føre til negative graviditetsresultater. Hos mus var måling af jernstrømme over moderkagen traditionelt afhængig af radioaktive jernisotoper, en meget følsom, men byrdefuld tilgang. Stabile jernisotoper (57Fe og 58Fe) er et ikke-radioaktivt alternativ til brug i graviditetsundersøgelser på mennesker.
Under fysiologiske forhold er transferrinbundet jern den dominerende form for jern, der optages af moderkagen. Således blev 58Fe-transferrin fremstillet og injiceret intravenøst i gravide dæmninger for direkte at vurdere placenta jerntransport og omgå maternel intestinal jernabsorption som en forvirrende variabel. Isotopisk jern blev kvantificeret i moderkagen og musens embryonale væv ved induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS). Disse metoder kan også anvendes i andre dyremodelsystemer af fysiologi eller sygdom for at kvantificere in vivo jerndynamik.
Introduction
Jern er afgørende for forskellige metaboliske processer, herunder vækst og udvikling, energiproduktion og ilttransport1. Vedligeholdelse af jernhomeostase er en dynamisk, koordineret proces. Jern absorberes fra mad i tolvfingertarmen og transporteres rundt i kroppen i cirkulationen bundet til jerntransportproteintransferrinet (Tf). Det bruges af hver celle til enzymatiske processer, inkorporeret i hæmoglobin i spirende erythrocytter og genbrugt fra alderen erythrocytter af makrofager. Jern opbevares i leveren, når det er overskydende og tabt fra kroppen gennem blødning eller cellesloughing. Mængden af jern i omløb er resultatet af balancen mellem forbruget og forsyningen af jern, hvor sidstnævnte er tæt reguleret af leverhormonet hepcidin (HAMP), den centrale regulator for jernhomeostase1. Hepcidin har til formål at begrænse jernbiotilgængeligheden i blodet ved at okkludere eller fremkalde ubiquitination og nedbryde jerneksportøren ferroportin (FPN)2. Reduktion i funktionel FPN fører til nedsat jernabsorption i kosten, jernbinding i leveren og nedsat jerngenanvendelse fra makrofager1.
Hepcidin reguleres af jernstatus, betændelse, erythropoietisk drev og graviditet (gennemgået i 3). I betragtning af at jernhomeostase er meget dynamisk, er det vigtigt at forstå og måle den samlede jernpulje og jernfordeling og omsætning. Dyreforsøg var traditionelt afhængige af radioaktive jernisotoper, en meget følsom, men byrdefuld tilgang til måling af jerndynamik. I nyere undersøgelser, herunder den her præsenteredeundersøgelse 4, anvendes imidlertid ikke-radioaktive, stabile jernisotoper (58Fe) til at måle jerntransport under graviditet 5,6,7,8,9. Stabile isotoper er værdifulde værktøjer til at studere næringsstofmetabolisme (gennemgået i 10). Anvendelsen af stabile jernisotoper i humane undersøgelser viste, at i) jernabsorptionen øges mod slutningen af drægtigheden5,6, ii) overførsel af jern i kosten til fosteret er afhængig af moderens jernstatus7, iii) maternelt indtaget hæmjern inkorporeres lettere af fosteret end nonheme jern 8, og iv) jernoverførsel til fosteret er negativt korreleret med moderens hepcidinniveauer 8, 9. Disse eksperimenter målte jernisotoper i sera eller deres inkorporering i RBC’er; måling af jern, der er inkorporeret i RBC’er alene, kan dog undervurdere ægte jernabsorption9. I den aktuelle undersøgelse måles både hæm og nonheme jern i væv.
Under graviditeten kræves jern for at understøtte udvidelsen af moderens røde blodlegemevolumen og til overførsel over moderkagen for at understøtte fostrets vækst og udvikling11. Føtal jernbegavelse er helt afhængig af jerntransport over moderkagen. Under human12 og gnaver 4,13 graviditet, hepcidin niveauer dramatisk falde, øge plasma jern tilgængelighed til overførsel til fosteret.
Grundlaget for placenta jerntransport blev oprindeligt karakteriseret i 1950’erne-70’erne ved hjælp af radioaktive sporstoffer (59Fe og 55Fe). Disse undersøgelser fastslog, at jerntransport over moderkagen er ensrettet 14,15, og at diferrisk transferrin er en vigtig kilde til jern til moderkagen og fosteret 16,17. Den nuværende forståelse af placentajerntransport er mere fuldstændig, selv om nogle vigtige jerntransportører og reguleringsmekanismer stadig er ukendte. Musemodeller har været afgørende for at forstå jernregulering og transport18, fordi de vigtigste transportører og mekanismer er bemærkelsesværdigt ens. Både menneskelige og mus placenta er hæmochorial, det vil sige moderens blod er i direkte kontakt med fosterkorionen19. Der er dog nogle bemærkelsesværdige strukturelle forskelle.
Syncytiotrophoblast er placentacellelaget, der adskiller moderens og fostrets cirkulation og aktivt transporterer jern og andre næringsstoffer20. Hos mennesker er syncytiotrophoblast et enkelt lag af smeltede celler. I modsætning hertil består musens moderkage af to syncytiotrophoblast lag21, Syn-I og Syn-II. Imidlertid tillader mellemrumskryds ved grænsefladen mellem Syn-I og Syn-II diffusion af næringsstoffer mellem lag22,23. Således fungerer disse lag som et enkelt synkront lag svarende til den menneskelige syncytiotrophoblast. Yderligere ligheder og forskelle mellem moderkage til mennesker og mus gennemgås af Rossant og Cross21. Placental jerntransport udløses ved binding af jern-Tf fra moderblod til transferrinreceptoren (TfR1) lokaliseret på den apikale side af syncytiotrophoblast24. Denne interaktion inducerer jern-Tf / TfR1 internalisering via clathrin-medieret endocytose25. Jern frigives derefter fra Tf i det sure endosom26, reduceres til jernholdigt jern ved en ubestemt ferrireduktase og eksporteres fra endosomet til cytoplasmaet af en endnu ikke bestemt transportør. Hvordan jern chaperoned inden for syncytiotrophoblast er også stadig at beskrive. Jern transporteres til sidst til fostersiden af jerneksportøren, FPN, lokaliseret på den basale eller fostervendte overflade af syncytiotrophoblast (gennemgået i27).
For at forstå, hvordan fysiologisk og patologisk regulering af TfR1, FPN og hepcidin påvirker placenta jerntransport, blev stabile jernisotoper brugt til at kvantificere jerntransport fra moderens cirkulation til moderkagen og embryoet in vivo4. Dette papir præsenterer metoderne til fremstilling og administration af isotopisk jernoverføringsmiddel til gravide mus, behandling af væv til ICP-MS og beregning af jernkoncentrationer i væv. Brugen af stabile jernisotoper in vivo kan tilpasses til at undersøge jernregulering og fordeling i forskellige dyremodeller for at undersøge fysiologisk og patologisk jernregulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jern er vigtigt for mange biologiske processer, og dets bevægelse og fordeling i kroppen er meget dynamisk og reguleret. Stabile jernisotoper giver et konsekvent og bekvemt alternativ til radioaktive isotoper til vurdering af dynamikken i jernhomeostase. Et kritisk skridt i protokollen er at holde styr på alle vævsvægte og volumener. Jern er et element og kan derfor ikke syntetiseres eller nedbrydes. Således, hvis alle vægte og volumener er omhyggeligt logget, kan alt jern i systemet redegøres for ved beregning. S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender brugen af ICP-MS-anlægget inden for UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology i CNSI på UCLA for deres hjælp med at optimere protokollen til 58Fe-målinger. Undersøgelsen blev støttet af NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, til VS) og NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, til EN).
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
- Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
- Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
- Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
- Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
- Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
- O’Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
- Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
- Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
- Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
- Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, 1567-1574 (2017).
- van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
- Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
- Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
- Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
- Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
- Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
- Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
- Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
- Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport–a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
- Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
- Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
- Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
- Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
- McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
- Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
- Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
- Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
- Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
- Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
- Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).
