Bu makalede, fare gebeliğinde demir taşıma çalışmaları için transferrine bağlı radyoaktif olmayan izotopik demirin nasıl hazırlanacağı ve uygulanacağı gösterilmektedir. Fetoplasental bölmelerde izotopik demirin miktarının belirlenmesi yaklaşımı da açıklanmaktadır.
Demir, hamilelik sırasında anne ve fetal sağlık için gereklidir ve sağlıklı bir hamileliği sürdürmek için insanlarda yaklaşık 1 g demir gerekir. Fetal demir bağışı tamamen plasenta boyunca demir transferine bağlıdır ve bu transferin pertürbasyonları olumsuz gebelik sonuçlarına yol açabilir. Farelerde, plasenta boyunca demir akışlarının ölçümü geleneksel olarak radyoaktif demir izotoplarına dayanıyordu, bu oldukça hassas ama külfetli bir yaklaşımdı. Kararlı demir izotopları (57Fe ve 58Fe), insan gebelik çalışmalarında kullanılmak üzere radyoaktif olmayan bir alternatif sunar.
Fizyolojik koşullar altında, transferrine bağlı demir, plasenta tarafından alınan demirin baskın şeklidir. Bu nedenle, plasental demir taşınımını doğrudan değerlendirmek ve kafa karıştırıcı bir değişken olarak maternal intestinal demir emilimini atlamak için 58Fe-transferrin hazırlandı ve gebe barajlarda intravenöz olarak enjekte edildi. İzotopik demir, plasenta ve fare embriyonik dokularında endüktif olarak eşleşmiş plazma kütle spektrometrisi (ICP-MS) ile kantite edildi. Bu yöntemler, in vivo demir dinamiklerini ölçmek için fizyoloji veya hastalığın diğer hayvan modeli sistemlerinde de kullanılabilir.
Demir, büyüme ve gelişme, enerji üretimi ve oksijen taşınması dahil olmak üzere çeşitli metabolik süreçler için kritiköneme sahiptir 1. Demir homeostazının bakımı dinamik, koordineli bir süreçtir. Demir, duodenumdaki gıdalardan emilir ve demir taşıma proteini transferrinine (Tf) bağlı dolaşımda vücudun etrafında taşınır. Her hücre tarafından enzimatik işlemler için kullanılır, yeni ortaya çıkan eritrositlerde hemoglobine dahil edilir ve makrofajlar tarafından yaşlı eritrositlerden geri dönüştürülür. Demir, aşırı olduğunda karaciğerde depolanır ve kanama veya hücre dökülmesi yoluyla vücuttan kaybolur. Dolaşımdaki demir miktarı, tüketim ile demir arzı arasındaki dengenin sonucudur, ikincisi, demir homeostazının merkezi düzenleyicisi olan hepatik hormon hepcidin (HAMP) tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir1. Hepcidin, her yerde bulunmasını engelleyerek veya indükleyerek ve demir ihracatçısı ferroportini (FPN) bozarak kandaki demir biyoyararlanımını sınırlamak için işlev görür2. Fonksiyonel FPN’deki azalma, diyetle demir emiliminin azalmasına, karaciğerde demir tutulmasına ve makrofajlardan demir geri dönüşümünün azalmasına yol açar1.
Hepcidin demir durumu, inflamasyon, eritropoietik sürücü ve gebelik ile düzenlenir (3’te gözden geçirilmiştir). Demir homeostazının oldukça dinamik olduğu göz önüne alındığında, toplam demir havuzunu ve demir dağılımını ve cirosunu anlamak ve ölçmek önemlidir. Hayvan çalışmaları geleneksel olarak demir dinamiklerini ölçmek için oldukça hassas ancak külfetli bir yaklaşım olan radyoaktif demir izotoplarına dayanıyordu. Bununla birlikte, burada sunulan çalışma da dahil olmak üzere daha yeni çalışmalarda4, gebelik sırasında demir taşınımını ölçmek için radyoaktif olmayan, kararlı demir izotopları (58Fe) kullanılmaktadır 5,6,7,8,9. Kararlı izotoplar, besin metabolizmasını incelemek için değerli araçlardır (10’da gözden geçirilmiştir). İnsan çalışmalarında stabil demir izotoplarının kullanımı, i) demir emiliminin gebeliğin sonuna doğru arttığınıgöstermiştir 5,6, ii) diyet demirinin fetüse transferinin maternal demir durumuna bağlı olduğu7, iii) maternal olarak alınan heme demiri, fetüs tarafından nonheme demir 8’den daha kolay dahil edilir ve iv) fetüse demir transferinin maternal hepcidin seviyeleri 8 ile negatif korelasyon gösterir, 9. Bu deneyler serumlardaki demir izotoplarını veya RBC’lere dahil edilmelerini ölçtü; Bununla birlikte, yalnızca RBC’lere dahil edilen demirin ölçümü, gerçek demir emilimini hafife alabilir9. Bu çalışmada, dokularda hem heme hem de nonheme demir ölçülmüştür.
Hamilelik sırasında, maternal kırmızı kan hücresi hacminin genişlemesini desteklemek ve fetüsün büyümesini ve gelişmesini desteklemek için plasenta boyunca transfer için demir gereklidir11. Fetal demir bağışı tamamen plasenta boyunca demir taşınmasına bağlıdır. İnsan 12 ve kemirgen 4,13 gebelik sırasında, hepcidin seviyeleri önemli ölçüde azalır ve fetüse transfer için plazma demir mevcudiyetini arttırır.
Plasental demir taşımacılığının temelleri başlangıçta 1950-70’lerde radyoaktif izleyiciler (59Fe ve 55Fe) kullanılarak karakterize edildi. Bu çalışmalar, plasenta boyunca demir taşınmasının tek yönlü 14,15 olduğunu ve diferrik transferrinin plasenta ve fetüs 16,17 için önemli bir demir kaynağı olduğunu belirlemiştir. Plasental demir taşımacılığının mevcut anlayışı daha eksiksizdir, ancak bazı önemli demir taşıyıcıları ve düzenleyici mekanizmalar bilinmemektedir. Fare modelleri, demir regülasyonu ve nakliyesini anlamak için çok önemlidir18, çünkü kilit taşıyıcılar ve mekanizmalar oldukça benzerdir. Hem insan hem de fare plasentası hemokoriyaldir, yani maternal kan fetal koryon19 ile doğrudan temas halindedir. Bununla birlikte, bazı dikkate değer yapısal farklılıklar vardır.
Sinsitiyotrofoblast, maternal ve fetal dolaşımı ayıran ve aktif olarak demir ve diğer besin maddelerini taşıyan plasental hücre tabakasıdır20. İnsanlarda, sinsitiyotrofoblast, kaynaşmış hücrelerin tek bir tabakasıdır. Buna karşılık, fare plasentası iki sinsitiyotrofoblast katmanı21, Syn-I ve Syn-II’den oluşur. Bununla birlikte, Syn-I ve Syn-II’nin arayüzündeki boşluk kavşakları, besinlerin22,23 katmanları arasında difüzyonuna izin verir. Böylece, bu katmanlar insan sinsitiyotrofoblastına benzer tek bir sinsitial tabaka olarak işlev görür. İnsan ve fare plasentası arasındaki ek benzerlikler ve farklılıklar Rossant ve Cross21 tarafından gözden geçirilmiştir. Plasental demir transportu, demir-Tf’nin maternal kandan sinsitiyotrofoblast24’ün apikal tarafında lokalize olan transferrin reseptörüne (TfR1) bağlanmasıyla tetiklenir. Bu etkileşim, klatrin aracılı endositoz25 yoluyla demir-Tf / TfR1 içselleşmesini indükler. Demir daha sonra asidik endozom26’daki Tf’den salınır, belirlenemeyen bir ferriredüktaz tarafından demirli demire indirgenir ve endozomdan henüz belirlenmemiş bir taşıyıcı tarafından sitoplazmaya ihraç edilir. Demirin sinsitiyotrofoblast içinde nasıl chaperonize edildiği de açıklanmaya devam etmektedir. Demir sonunda demir ihracatçısı FPN tarafından fetal tarafa taşınır, sinsitiyotrofoblastın bazal veya fetale bakan yüzeyinde lokalize edilir (27’de gözden geçirilmiştir).
TfR1, FPN ve hepcidinin fizyolojik ve patolojik regülasyonunun plasental demir taşınımını nasıl etkilediğini anlamak için, maternal dolaşımdan plasentaya ve embriyoya demir taşınımını in vivo4’e arttırmak için stabil demir izotopları kullanılmıştır. Bu yazıda gebe farelere izotopik demir transferrin hazırlanması ve uygulanması, ICP-MS için dokuların işlenmesi ve dokulardaki demir konsantrasyonlarının hesaplanması için yöntemler sunulmaktadır. İn vivo stabil demir izotoplarının kullanımı, fizyolojik ve patolojik demir regülasyonunu araştırmak için farklı hayvan modellerinde demir regülasyonunu ve dağılımını araştırmak için uyarlanabilir.
Demir birçok biyolojik süreç için önemlidir ve vücuttaki hareketi ve dağılımı oldukça dinamik ve düzenlenmiştir. Kararlı demir izotopları, demir homeostazının dinamiklerinin değerlendirilmesi için radyoaktif izotoplara tutarlı ve uygun bir alternatif sağlar. Protokoldeki kritik bir adım, tüm doku ağırlıklarını ve hacimlerini takip etmektir. Demir bir elementtir ve bu nedenle sentezlenemez veya parçalanamaz. Böylece, tüm ağırlıklar ve hacimler dikkatlice günlüğe kaydedilirse, sistem i?…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar, UCLA’daki CNSI’daki UC Nanoteknolojinin Çevresel Etkileri Merkezi’ndeki ICP-MS tesisinin kullanımını, 58Fe ölçümleri için protokolü optimize etmedeki yardımları için kabul etmektedir. Çalışma, NIH Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK) (K01DK127004, VS’ye) ve NIH Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsani Gelişme Enstitüsü (NICHD) (R01HD096863, EN’ye) tarafından desteklenmiştir.
58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
Isoflurane | VETone | 502017 | |
Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
Metal heat block | Fisher Scientific | ||
Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
Software | |||
ImageLab | Bio-Rad | ||
SigmaPlot | Systat |