הובלת ברזל כמותית על פני שליבת העכבר In Vivo באמצעות איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי
Summary
מאמר זה מדגים כיצד להכין ולנהל ברזל איזוטופי לא-רדיואקטיבי הקשור לטרנספרין למחקרים על הובלת ברזל בהריון עכבר. כמו כן מתוארת הגישה לכימות ברזל איזוטופי בתאי fetoplacental.
Abstract
ברזל חיוני לבריאות האם והעובר במהלך ההריון, כאשר כ-1 גרם ברזל דרושים בבני אדם כדי לקיים הריון בריא. הקדשת ברזל עוברית תלויה לחלוטין בהעברת ברזל על פני השליה, והפרעות בהעברה זו עלולות להוביל לתוצאות הריון שליליות. בעכברים, מדידת שטפי הברזל על פני השליה הסתמכה באופן מסורתי על איזוטופים של ברזל רדיואקטיבי, גישה רגישה מאוד אך מעיקה. איזוטופים יציבים מברזל (57 Fe ו-58Fe) מציעים חלופה לא-רדיואקטיבית לשימוש במחקרי הריון אנושי.
בתנאים פיזיולוגיים, ברזל הקשור לטרנספרין הוא הצורה השלטת של ברזל שנלקחה על ידי השליה. לפיכך, 58Fe-transferrin הוכן והוזרק לווריד בסכרים בהריון כדי להעריך ישירות את הובלת ברזל השליה ולעקוף את ספיגת הברזל במעיים האימהיים כמשתנה מבלבל. ברזל איזוטופי היה כמותי ברקמות עובריות של השליה והעכברים על ידי ספקטרומטריית מסת פלזמה מצומדת אינדוקטיבית (ICP-MS). ניתן להשתמש בשיטות אלה גם במערכות אחרות של מודלים של בעלי חיים של פיזיולוגיה או מחלות כדי לכמת את דינמיקת הברזל in vivo .
Introduction
ברזל חיוני לתהליכים מטבוליים שונים, כולל גדילה והתפתחות, ייצור אנרגיה והובלת חמצן1. תחזוקה של הומאוסטזיס ברזל הוא תהליך דינמי ומתואם. ברזל נספג מהמזון בתריסריון ומועבר ברחבי הגוף במחזור הדם הקשור להעברת חלבון הובלת הברזל (Tf). הוא מנוצל על ידי כל תא לתהליכים אנזימטיים, משולב בהמוגלובין באריתרוציטים מתהווים, וממוחזר מאריתרוציטים מיושנים על ידי מקרופאגים. ברזל מאוחסן בכבד כאשר עודף ואבד מהגוף באמצעות דימום או sloughing התא. כמות הברזל במחזור היא תוצאה של האיזון בין הצריכה לבין אספקת הברזל, האחרון להיות מוסדר היטב על ידי הורמון הכבד hepcidin (HAMP), הרגולטור המרכזי של ברזל הומאוסטזיס1. הפצידין מתפקד כדי להגביל את הזמינות הביולוגית של ברזל בדם על ידי חסימה או גרימת יוביקוויטין והשפלת יצואנית הברזל פרופורטין (FPN)2. הפחתה ב-FPN התפקודי מובילה לירידה בספיגת ברזל בתזונה, לפירוק ברזל בכבד ולירידה במיחזור ברזל ממקרופאגים1.
הפצידין מווסת על ידי מצב ברזל, דלקת, דחף אריתרופויטי והריון (נבדק ב -3). בהתחשב בכך שהומאוסטזיס ברזל הוא דינמי מאוד, חשוב להבין ולמדוד את סך מאגר הברזל ואת התפלגות הברזל ותחלופתו. מחקרים בבעלי חיים הסתמכו באופן מסורתי על איזוטופים של ברזל רדיואקטיבי, גישה רגישה מאוד אך מעיקה למדידת הדינמיקה של ברזל. עם זאת, במחקרים עדכניים יותר, כולל המחקר המוצג כאן4, איזוטופים של ברזל לא רדיואקטיבי ויציב (58Fe) משמשים למדידת הובלת ברזל במהלך ההריון 5,6,7,8,9. איזוטופים יציבים הם כלים חשובים לחקר חילוף החומרים של חומרים מזינים (נבדקו ב-10). השימוש באיזוטופים יציבים של ברזל במחקרים בבני אדם הראה כי 1) ספיגת הברזל עולה לקראת סוף ההיריון5,6, ii) העברת ברזל תזונתי לעובר תלויה במצב הברזל האימהי7, 3) ברזל heme שנבלע אימהי משולב בקלות רבה יותר על ידי העובר מאשר ברזל nonheme 8, ו- 4) העברת ברזל לעובר מתואמת שלילית עם רמות hepcidin אימהי 8, 9. ניסויים אלה מדדו איזוטופים של ברזל בסרה או שילובם ב-RBCs; עם זאת, מדידה של ברזל המשולב ב-RBCs בלבד עלולה לזלזל בספיגת ברזלאמיתית 9. במחקר הנוכחי, הן heme והן ברזל nonheme נמדדים ברקמות.
במהלך ההריון, ברזל נדרש כדי לתמוך בהרחבת נפח תאי הדם האדומים האימהיים ולהעברה על פני השליה כדי לתמוך בגדילה ובהתפתחות של העובר11. הקדשת ברזל עוברית תלויה לחלוטין בהובלת ברזל על פני השליה. במהלך הריון12 אנושי ומכרסם 4,13, רמות ההפצידין יורדות באופן דרמטי, מה שמגדיל את זמינות ברזל הפלזמה להעברה לעובר.
היסודות של הובלת ברזל שליה אופיינו בתחילה בשנות החמישים וה -70 באמצעות עקבות רדיואקטיביים (59Fe ו 55Fe). מחקרים אלה קבעו כי שינוע הברזל על פני השליה הואחד-כיווני 14,15 וכי טרנספרין דיפרי הוא מקור עיקרי לברזל עבור השליה והעובר16,17. ההבנה הנוכחית של הובלת ברזל שליה שלמה יותר, אם כי כמה מובילי ברזל מרכזיים ומנגנוני ויסות עדיין לא ידועים. מודלים של עכברים היו חיוניים להבנת ויסות ברזל ותעבורה18 מכיוון שהמובילים והמנגנונים המרכזיים דומים להפליא. הן השליה האנושית והן השליה העכברית הן המוכוריאליות, כלומר, הדם האימהי נמצא במגע ישיר עם כוריון העובר19. עם זאת, ישנם כמה הבדלים מבניים בולטים.
ה- syncytiotrophoblast היא שכבת תאי השליה המפרידה בין מחזור הדם האימהי והעוברי ומעבירה באופן פעיל ברזל וחומרים מזינים אחרים20. בבני אדם, הסינקטיוטרופובלסט הוא שכבה אחת של תאים מתמזגים. לעומת זאת, שליית העכבר מורכבת משתי שכבות סינכטיוטרופובלסט21, Syn-I ו- Syn-II. עם זאת, צמתי מרווחים בממשק של Syn-I ו- Syn-II מאפשרים דיפוזיה של חומרים מזינים בין שכבות22,23. לפיכך, שכבות אלה מתפקדות כשכבה סינסיטיאלית אחת הדומה לסינכטיוטרופובלסט האנושי. קווי דמיון והבדלים נוספים בין שליה אנושית לעכבר נבדקים על ידי Rossant ו- Cross21. הובלת ברזל שליה מופעלת על ידי קשירת ברזל-Tf מדם אימהי לקולטן טרנספרין (TfR1) הממוקם בצד האפיקלי של הסינכטיוטרופובלסט24. אינטראקציה זו גורמת להפנמה של ברזל-Tf/TfR1 באמצעות אנדוציטוזה בתיווך קלתרין25. לאחר מכן הברזל משתחרר מ-Tf באנדוזום26 החומצי, מצטמצם לברזל ברזלי על ידי פרירדוקטאז שלא נקבע, ומיוצא מהאנדוזום לציטופלסמה על ידי טרנספורטר שטרם נקבע. כיצד ברזל מלווה בתוך syncytiotrophoblast גם נשאר לתאר. ברזל מועבר בסופו של דבר לצד העוברי על ידי יצואן הברזל, FPN, הממוקם על פני השטח הבסיסיים או העובריים של הסינסיטיוטרופובלסט (נבדק ב-27).
כדי להבין כיצד ויסות פיזיולוגי ופתולוגי של TfR1, FPN והפצידין משפיע על הובלת ברזל שליה, נעשה שימוש באיזוטופים של ברזל יציב כדי לבצע הובלת ברזל כמותית ממחזור הדם האימהי אל השליה והעובר in vivo4. מאמר זה מציג את השיטות להכנה ולמתן איזוטופי של ברזל-טרנספרין לעכברות הרות, עיבוד רקמות עבור ICP-MS וחישוב ריכוזי הברזל ברקמות. ניתן להתאים את השימוש באיזוטופים יציבים של ברזל in vivo כדי לחקור ויסות ופיזור ברזל במודלים שונים של בעלי חיים כדי לחקור ויסות ברזל פיזיולוגי ופתולוגי.
Protocol
Representative Results
Discussion
ברזל חשוב לתהליכים ביולוגיים רבים, ותנועתו והפצתו בגוף הן דינמיות ומווסתות מאוד. איזוטופים יציבים מברזל מספקים חלופה עקבית ונוחה לאיזוטופים רדיואקטיביים להערכת הדינמיקה של הומאוסטזיס ברזל. שלב קריטי בפרוטוקול הוא מעקב אחר כל המשקלים והנפחים של הרקמות. ברזל הוא יסוד ולכן לא ניתן לסנתז או…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על השימוש במתקן ICP-MS במרכז UC להשלכות סביבתיות של ננוטכנולוגיה ב-CNSI באוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג’לס על עזרתם באופטימיזציה של הפרוטוקול למדידות 58Fe. המחקר נתמך על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות של NIH (NIDDK) (K01DK127004, to VS) והמכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) (R01HD096863, ל-EN).
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
- Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
- Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
- Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
- Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
- Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
- O’Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
- Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
- Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
- Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
- Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, 1567-1574 (2017).
- van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
- Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
- Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
- Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
- Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
- Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
- Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
- Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
- Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport–a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
- Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
- Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
- Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
- Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
- McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
- Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
- Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
- Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
- Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
- Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
- Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).
