非放射性鉄同位体を用いたマウス胎盤 を 横切る鉄輸送の定量
Summary
この記事では、マウス妊娠中の鉄輸送の研究のために、トランスフェリン結合非放射性同位体鉄を調製および投与する方法を示します。胎児胎盤区画中の同位体鉄を定量するためのアプローチも記載されている。
Abstract
鉄は妊娠中の母体と胎児の健康に不可欠であり、健康な妊娠を維持するために人間には約1gの鉄が必要です。胎児の鉄の供給は胎盤を横切る鉄の移動に完全に依存しており、この移動の摂動は妊娠に悪影響を与える可能性があります。マウスでは、胎盤を横切る鉄フラックスの測定は、伝統的に放射性鉄同位体に依存していましたが、これは非常に敏感ですが負担の大きいアプローチでした。安定鉄同位体(57Feおよび 58Fe)は、ヒトの妊娠研究で使用するための非放射性の代替物を提供します。
生理学的条件下では、トランスフェリン結合鉄は胎盤に取り込まれる鉄の主な形態です。したがって、 58Fe-トランスフェリンを調製し、妊娠中のダムに静脈内注射して、胎盤鉄輸送を直接評価し、交絡変数として母親の腸内鉄吸収をバイパスしました。同位体鉄は、誘導結合血漿質量分析(ICP-MS)によって胎盤およびマウス胚組織において定量された。これらの方法は、生理学または疾患の他の動物モデル系において、 in vivo 鉄動態を定量化するためにも使用することができる。
Introduction
鉄は、成長と発達、エネルギー生産、酸素輸送など、さまざまな代謝プロセスに不可欠です1。鉄の恒常性の維持は、動的で調整されたプロセスです。鉄は十二指腸で食物から吸収され、鉄輸送タンパク質トランスフェリン(Tf)に結合して循環して体内を輸送されます。これは、酵素プロセスのためにすべての細胞によって利用され、新生赤血球のヘモグロビンに取り込まれ、マクロファージによって老化赤血球からリサイクルされます。鉄は過剰になると肝臓に貯蔵され、出血や細胞脱落によって体から失われます。循環中の鉄の量は、鉄の消費と供給のバランスの結果であり、後者は鉄の恒常性の中心的な調節因子である肝ホルモンヘプシジン(HAMP)によって厳しく調節されています1。ヘプシジンは、ユビキチン化を閉塞または誘導し、鉄輸出者フェロポーチン(FPN)を分解することにより、血中の鉄バイオアベイラビリティを制限する働きをします2。機能性FPNの減少は、食事中の鉄吸収の減少、肝臓での鉄隔離、およびマクロファージからの鉄リサイクルの減少につながります1。
ヘプシジンは、鉄の状態、炎症、赤血球生成ドライブ、および妊娠によって調節されている(3でレビュー)。鉄の恒常性は非常に動的であることを考えると、鉄プールと鉄の分布と回転率の合計を理解して測定することが重要です。動物実験は伝統的に放射性鉄同位体に依存していましたが、これは鉄のダイナミクスを測定するための非常に感度が高くて負担の大きいアプローチです。しかし、ここで紹介した研究4を含む最近の研究では、非放射性の安定な鉄同位体(58Fe)が妊娠中の鉄輸送を測定するために利用されています5,6,7,8,9。安定同位体は、栄養代謝を研究するための貴重なツールです(10でレビュー)。ヒトの研究における安定鉄同位体の使用は、i)妊娠の終わりに向かって鉄吸収が増加する5,6、ii)胎児への食事性鉄の移動は母親の鉄の状態に依存する7、iii)母親が摂取したヘム鉄は非ヘム鉄8よりも胎児に取り込まれやすい、iv)胎児への鉄の移動は母親のヘプシジンレベル8と負の相関があることを示した。9.これらの実験では、血清中の鉄同位体または赤血球への鉄同位体の取り込みを測定しました。ただし、赤血球に取り込まれた鉄の測定だけでは、真の鉄吸収を過小評価する可能性があります9。現在の研究では、ヘム鉄と非ヘム鉄の両方が組織で測定されています。
妊娠中、鉄は母体の赤血球量の拡大をサポートし、胎児の成長と発達をサポートするために胎盤を横切る移動に必要です11。胎児の鉄の供給は、胎盤を横切る鉄の輸送に完全に依存しています。ヒト12およびげっ歯類4,13の妊娠中、ヘプシジンレベルは劇的に減少し、胎児への移送のための血漿鉄の利用可能性を増加させる。
胎盤鉄輸送の基礎は、1950年代から70年代に放射性トレーサー(59Feおよび55Fe)を使用して最初に特徴付けられました。これらの研究により、胎盤を横切る鉄輸送は一方向であり14,15、二鉄トランスフェリンは胎盤と胎児の主要な鉄源であると判断されました16,17。胎盤鉄輸送の現在の理解はより完全ですが、いくつかの重要な鉄輸送体と調節メカニズムは不明のままです。マウスモデルは、主要な輸送体とメカニズムが非常に類似しているため、鉄の調節と輸送を理解するために不可欠でした18。ヒト胎盤とマウス胎盤の両方が血脈性であり、すなわち、母体血は胎児絨毛膜19と直接接触している。ただし、いくつかの顕著な構造上の違いがあります。
合胞体栄養膜は、母体と胎児の循環を分離し、鉄や他の栄養素を積極的に輸送する胎盤細胞層です20。ヒトでは、合胞体栄養膜は融合細胞の単層です。対照的に、マウス胎盤は、2つの合胞体栄養膜層21、Syn-IおよびSyn-IIからなる。しかしながら、Syn−IおよびSyn−IIの界面におけるギャップ結合は、層22、23間の栄養素の拡散を可能にする。したがって、これらの層は、ヒトの合胞体栄養膜と同様の単一の合胞体層として機能する。ヒト胎盤とマウス胎盤のさらなる類似点と相違点は、RossantとCross21によってレビューされています。胎盤鉄輸送は、母体血からシンシチオトロフォブラスト24の頂端側に局在するトランスフェリン受容体(TfR1)への鉄-Tfの結合によって引き起こされる。この相互作用は、クラスリンを介したエンドサイトーシスを介して鉄-Tf/TfR1のインターナリゼーションを誘導します25。その後、鉄は酸性エンドソーム26のTfから放出され、未決定のフェリレダクターゼによって第一鉄に還元され、まだ決定されていないトランスポーターによってエンドソームから細胞質に輸出されます。鉄が合胞体栄養膜内でどのようにシャペロン化されるかもまだ説明されていません。鉄は最終的に、合胞体栄養膜の基底面または胎児に面した表面に局在する鉄輸出者FPNによって胎児側に輸送される(27でレビュー)。
TfR1、FPN、およびヘプシジンの生理学的および病理学的調節が胎盤の鉄輸送にどのように影響するかを理解するために、安定鉄同位体を利用して、母体循環から胎盤および胚への鉄輸送をin vivoで定量しました4。この論文では、妊娠マウスへの同位体鉄トランスフェリンの調製と投与、ICP-MSのための組織の処理、および組織内の鉄濃度の計算方法を紹介します。in vivoでの安定鉄同位体の使用は、生理学的および病理学的鉄調節を調査するために、異なる動物モデルにおける鉄の調節および分布を調べるために適応させることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
鉄は多くの生物学的プロセスにとって重要であり、体内でのその動きと分布は非常に動的で調節されています。安定鉄同位体は、鉄恒常性のダイナミクスを評価するための放射性同位元素の一貫した便利な代替品を提供します。プロトコルの重要なステップは、すべての組織の重量と体積を追跡することです。鉄は元素であるため、合成も分解もできません。したがって、すべての重量と体?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、UCLAのCNSIにあるUCナノテクノロジー環境影響センター内のICP-MS施設が、 58Fe測定のプロトコルの最適化を支援するために使用されていることを認めています。この研究は、NIH国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所(NIDDK)(K01DK127004、VSへ)およびNIH国立小児保健人間発達研究所(NICHD)(R01HD096863、EN)の支援を受けた。
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
- Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
- Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
- Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
- Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
- Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
- O’Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
- Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
- Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
- Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
- Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, 1567-1574 (2017).
- van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
- Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
- Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
- Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
- Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
- Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
- Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
- Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
- Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport–a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
- Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
- Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
- Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
- Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
- McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
- Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
- Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
- Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
- Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
- Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
- Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).
