Kvantifisering av jerntransport over musemorkaken in vivo ved bruk av ikke-radioaktive jernisotoper
Summary
Denne artikkelen demonstrerer hvordan man tilbereder og administrerer transferrinbundet ikke-radioaktivt isotopjern for studier av jerntransport ved musegraviditet. Tilnærmingen for kvantifisering av isotopjern i fetoplacentale rom er også beskrevet.
Abstract
Jern er viktig for mors og fosterets helse under svangerskapet, med ca 1 g jern som trengs hos mennesker for å opprettholde en sunn graviditet. Fosterets jernbegavelse er helt avhengig av jernoverføring over morkaken, og forstyrrelser av denne overføringen kan føre til uønskede svangerskapsutfall. Hos mus var måling av jernflukser over morkaken tradisjonelt avhengig av radioaktive jernisotoper, en svært følsom, men belastende tilnærming. Stabile jernisotoper (57Fe og 58Fe) tilbyr et ikke-radioaktivt alternativ for bruk i humane graviditetsstudier.
Under fysiologiske forhold er transferrinbundet jern den dominerende formen for jern tatt opp av morkaken. Således ble 58Fe-transferrin fremstilt og injisert intravenøst i gravide dammer for direkte å vurdere placental jerntransport og omgå mors intestinal jernabsorpsjon som en forvirrende variabel. Isotopisk jern ble kvantifisert i placenta og mus embryonale vev ved induktivt koblet plasmamassespektrometri (ICP-MS). Disse metodene kan også brukes i andre dyremodellsystemer av fysiologi eller sykdom for å kvantifisere in vivo jerndynamikk.
Introduction
Jern er kritisk for ulike metabolske prosesser, inkludert vekst og utvikling, energiproduksjon og oksygentransport1. Vedlikehold av jernhomeostase er en dynamisk, koordinert prosess. Jern tas opp fra mat i tolvfingertarmen og transporteres rundt i kroppen i sirkulasjonen som bindes til jerntransportproteintransferrinet (Tf). Den brukes av hver celle for enzymatiske prosesser, innlemmet i hemoglobin i begynnende erytrocytter, og resirkulert fra eldre erytrocytter av makrofager. Jern lagres i leveren når det er i overskudd og tapt fra kroppen gjennom blødning eller celle sloughing. Mengden jern i omløp er resultatet av balansen mellom forbruket og tilførselen av jern, sistnevnte er tett regulert av hepatisk hormon hepcidin (HAMP), den sentrale regulatoren av jernhomeostase1. Hepcidin fungerer for å begrense jernbiotilgjengeligheten i blod ved å okkludere eller indusere ubiquitination og nedbryte jerneksportøren ferroportin (FPN)2. Reduksjon i funksjonell FPN fører til redusert jernabsorpsjon, jernbinding i leveren og redusert jerngjenvinning fra makrofager1.
Hepcidin reguleres av jernstatus, betennelse, erytropoetisk kjøring og graviditet (vurdert i 3). Gitt at jernhomeostase er svært dynamisk, er det viktig å forstå og måle den totale jernpoolen og jernfordelingen og omsetningen. Dyrestudier var tradisjonelt avhengige av radioaktive jernisotoper, en svært følsom, men tyngende tilnærming for å måle jerndynamikk. Men i nyere studier, inkludert studien presentert her4, brukes ikke-radioaktive, stabile jernisotoper (58Fe) til å måle jerntransport under graviditet 5,6,7,8,9. Stabile isotoper er verdifulle verktøy for å studere næringsmetabolisme (gjennomgått i 10). Bruken av stabile jernisotoper i humane studier viste at i) jernabsorpsjonen øker mot slutten av svangerskapet5,6, ii) overføring av diettjern til fosteret er avhengig av mors jernstatus7, iii) maternalt inntatt hemejern er lettere innlemmet av fosteret enn nonheme jern 8, og iv) jernoverføring til fosteret er negativt korrelert med mors hepcidinnivå 8, 9. Disse eksperimentene målte jernisotoper i sera eller deres innlemmelse i RBC; måling av jern inkorporert i RBC alene kan imidlertid undervurdere sann jernabsorpsjon9. I den nåværende studien måles både heme og nonheme jern i vev.
Under graviditeten er det nødvendig med jern for å støtte utvidelsen av mors røde blodlegemer og for overføring over morkaken for å støtte veksten og utviklingen av fosteret11. Fosterets jernbegavelse er helt avhengig av jerntransport over morkaken. Under human12 og gnager 4,13 graviditet, reduseres hepcidinnivåene dramatisk, og øker plasmajerntilgjengeligheten for overføring til fosteret.
Grunnlaget for placental jerntransport ble opprinnelig karakterisert på 1950-70-tallet ved bruk av radioaktive sporstoffer (59Fe og 55Fe). Disse studiene fastslo at jerntransport over morkaken er ensrettet 14,15 og at diferrisk transferrin er en viktig kilde til jern for morkaken og fosteret 16,17. Den nåværende forståelsen av placental jerntransport er mer komplett, selv om noen viktige jerntransportører og reguleringsmekanismer forblir ukjente. Musemodeller har vært avgjørende for å forstå jernregulering og transport18 fordi nøkkeltransportørene og mekanismene er bemerkelsesverdig like. Både menneske og mus placentae er hemochorial, det vil si at mors blod er i direkte kontakt med fosterkorionen19. Det er imidlertid noen bemerkelsesverdige strukturelle forskjeller.
Syncytiotrophoblast er placentacellelaget som separerer mors og fosterets sirkulasjon og aktivt transporterer jern og andre næringsstoffer20. Hos mennesker er syncytiotrofobila et enkelt lag av smeltede celler. I motsetning til dette består musemorkaken av to syncytiotrofolastlag21, Syn-I og Syn-II. Imidlertid tillater gapkryss ved grensesnittet til Syn-I og Syn-II diffusjon av næringsstoffer mellom lag22,23. Dermed fungerer disse lagene som et enkelt syncytiallag som ligner på det humane syncytiotrofoblastet. Ytterligere likheter og forskjeller mellom menneske og mus placentae er gjennomgått av Rossant og Cross21. Placental jerntransport utløses ved binding av jern-Tf fra mors blod til transferrinreseptoren (TfR1) lokalisert på den apikale siden av syncytiotrofoblast24. Denne interaksjonen induserer jern-Tf/TfR1-internalisering via clathrinmediert endocytose25. Jern frigjøres deretter fra Tf i det sure endosomet26, reduseres til jernholdig jern av en ubestemt ferrireduktase, og eksporteres fra endosomet til cytoplasma av en ennå ikke bestemt transportør. Hvordan jern er chaperoned innenfor syncytiotrophoblast gjenstår også å bli beskrevet. Jern transporteres til slutt til fostersiden av jerneksportøren, FPN, lokalisert på den basale eller fostervendte overflaten av syncytiotrofoblast (gjennomgått i27).
For å forstå hvordan fysiologisk og patologisk regulering av TfR1, FPN og hepcidin påvirker placentajerntransport, ble stabile jernisotoper benyttet for å kvantifisere jerntransport fra mors sirkulasjon til morkaken og embryoet in vivo4. Dette papiret presenterer metodene for fremstilling og administrering av isotopisk jernoverføring til gravide mus, behandling av vev for ICP-MS og beregning av jernkonsentrasjoner i vev. Bruken av stabile jernisotoper in vivo kan tilpasses for å undersøke jernregulering og -fordeling i ulike dyremodeller for å undersøke fysiologisk og patologisk jernregulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Jern er viktig for mange biologiske prosesser, og dets bevegelse og distribusjon i kroppen er svært dynamisk og regulert. Stabile jernisotoper gir et konsistent og praktisk alternativ til radioaktive isotoper for vurdering av dynamikken i jernhomeostase. Et kritisk trinn i protokollen er å holde oversikt over alle vevsvekter og volumer. Jern er et element og kan derfor ikke syntetiseres eller brytes ned. Således, hvis alle vekter og volumer er nøye logget, kan alt jern i systemet regnskapsføres ved beregning. Som be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkjenner bruken av ICP-MS-anlegget i UC Center for Environmental Implications of Nanotechnology i CNSI ved UCLA for deres hjelp med å optimalisere protokollen for 58Fe-målinger. Studien ble støttet av NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (K01DK127004, til VS) og NIH National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) (R01HD096863, til EN).
Materials
| 58Fe-iron metal | Trace Sciences International | Fe-58 | |
| Amicon ultra-15 centrifugal filter, 30 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC903024 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 14-959-49B | |
| Centrifuge tubes, 50 mL | Millipore Sigma | CLS430829 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002432 | |
| Centrifuge, Sorvall Legend RT | |||
| Delicate task wipers | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Diet: iron-deficient (4 ppm iron) | Envigo Teklad | TD.80396 | |
| Diet: standard chow (185 ppm iron) | PicoLab | 5053 | |
| Dissecting scissor with 30 mm cutting edge | VWR | 25870-002 | |
| Forceps 4-1/2 inch length | McKesson | 157-469 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Homogenizer, Bio-Gen PRO200 | PROScientific | 01-01200 | |
| Human apo-transferrin (apo-Tf) | Celliance | 4452-01 | no longer available, alternative: Millipore 616419 |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Hydrogen peroxide (H2O2), 35 wt.% solution in water | Cole-Parmer | EW-88216-36 | |
| Insulin Syringes, BD Lo-Dose U-100 | Fisher Scientific | 14-826-79 | |
| Isoflurane | VETone | 502017 | |
| Isoflurane vaporizor | Summit Anesthesia Solutions | ||
| Metal heat block | Fisher Scientific | ||
| Micro centrifuge tube with flat screw-cap | VWR | 16466-064 | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Microcentrifuge tubes 2.0 mL low-retention | Fisher Scientific | 02-681-321 | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma-sterilized | Millipore Sigma | SLGP033RS | |
| Nitrilotriacetic acid (NTA) | Sigma | 72560-100G | |
| Needle 25 G x 5/8 in. hypodermic general use | Fisher Scientific | 14-826AA | |
| pH Strips, plastic pH5.0-9.0 | Fisher Scientific | 13-640-519 | |
| Razor blades 0.22 mm | VWR | 55411-050 | |
| Scale (g) | Mettler Toledo | PB1502-S | |
| Scale (mg) | Mettler Toledo | Balance XS204 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761-500G | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Sterile syringe, slip tip (1 mL) | Fisher Scientific | 309659 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-500 | |
| Software | |||
| ImageLab | Bio-Rad | ||
| SigmaPlot | Systat |
References
- Ganz, T. Systemic iron homeostasis. Physiological Reviews. 93 (4), 1721-1741 (2013).
- Aschemeyer, S., et al. Structure-function analysis of ferroportin defines the binding site and an alternative mechanism of action of hepcidin. Blood. 131 (8), 899-910 (2018).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Regulation of the iron homeostatic hormone hepcidin. Advances in Nutrition. 8 (1), 126-136 (2017).
- Sangkhae, V., et al. Effects of maternal iron status on placental and fetal iron homeostasis. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 625-640 (2020).
- Whittaker, P. G., Lind, T., Williams, J. G. Iron absorption during normal human pregnancy: a study using stable isotopes. British Journal of Nutrition. 65 (3), 457-463 (1991).
- Whittaker, P. G., Barrett, J. F., Lind, T. The erythrocyte incorporation of absorbed non-haem iron in pregnant women. British Journal of Nutrition. 86 (3), 323-329 (2001).
- O’Brien, K. O., Zavaleta, N., Abrams, S. A., Caulfield, L. E. Maternal iron status influences iron transfer to the fetus during the third trimester of pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 77 (4), 924-930 (2003).
- Young, M. F., et al. Maternal hepcidin is associated with placental transfer of iron derived from dietary heme and nonheme sources. Journal of Nutrition. 142 (1), 33-39 (2012).
- Delaney, K. M., et al. Iron absorption during pregnancy is underestimated when iron utilization by the placenta and fetus is ignored. American Journal of Clinical Nutrition. 112 (3), 576-585 (2020).
- Klatt, K. C., Smith, E. R., Barberio, M. D. Toward a more stable understanding of pregnancy micronutrient metabolism. American Journal of Physiology-Endocrinology Metabolism. 321 (2), 260-263 (2021).
- Fisher, A. L., Nemeth, E. Iron homeostasis during pregnancy. American Journal of Clinical Nutrition. 106, 1567-1574 (2017).
- van Santen, S., et al. The iron regulatory hormone hepcidin is decreased in pregnancy: a prospective longitudinal study. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 51 (7), 1395-1401 (2013).
- Millard, K. N., Frazer, D. M., Wilkins, S. J., Anderson, G. J. Changes in the expression of intestinal iron transport and hepatic regulatory molecules explain the enhanced iron absorption associated with pregnancy in the rat. Gut. 53 (5), 655-660 (2004).
- Bothwell, T. H., Pribilla, W. F., Mebust, W., Finch, C. A. Iron metabolism in the pregnant rabbit; iron transport across the placenta. American Journal of Physiology. 193 (3), 615-622 (1958).
- Dyer, N. C., Brill, A. B., Raye, J., Gutberlet, R., Stahlman, M. Maternal-fetal exchange of 59 Fe: radiation dosimetry and biokinetics in human and sheep studies. Radiation Research. 53 (3), 488-495 (1973).
- Contractor, S. F., Eaton, B. M. Role of transferrin in iron transport between maternal and fetal circulations of a perfused lobule of human placenta. Cell Biochemistry & Function. 4 (1), 69-74 (1986).
- Baker, E., Morgan, E. H. The role of transferrin in placental iron transfer in the rabbit. Quartly Jounrnal of Experimental Physiolology and Cognate Medical Sciences. 54 (2), 173-186 (1969).
- Fleming, R. E., Feng, Q., Britton, R. S. Knockout mouse models of iron homeostasis. Annual Review of Nutrition. 31, 117-137 (2011).
- Soares, M. J., Varberg, K. M., Iqbal, K. Hemochorial placentation: development, function, and adaptations. Biology of Reproduction. 99 (1), 196-211 (2018).
- Jones, H. N., Powell, T. L., Jansson, T. Regulation of placental nutrient transport–a review. Placenta. 28 (8-9), 763-774 (2007).
- Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature Reviews Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
- Takata, K., Kasahara, T., Kasahara, M., Ezaki, O., Hirano, H. Immunolocalization of glucose transporter GLUT1 in the rat placental barrier: possible role of GLUT1 and the gap junction in the transport of glucose across the placental barrier. Cell and Tissue Research. 276 (3), 411-418 (1994).
- Shin, B. C., et al. Immunolocalization of GLUT1 and connexin 26 in the rat placenta. Cell and Tissue Research. 285 (1), 83-89 (1996).
- Bastin, J., Drakesmith, H., Rees, M., Sargent, I., Townsend, A. Localisation of proteins of iron metabolism in the human placenta and liver. British Journal of Haematology. 134 (5), 532-543 (2006).
- Klausner, R. D., Ashwell, G., van Renswoude, J., Harford, J. B., Bridges, K. R. Binding of apotransferrin to K562 cells: explanation of the transferrin cycle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 80 (8), 2263-2266 (1983).
- Tsunoo, H., Sussman, H. H. Characterization of transferrin binding and specificity of the placental transferrin receptor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 225 (1), 42-54 (1983).
- Sangkhae, V., Nemeth, E. Placental iron transport: The mechanism and regulatory circuits. Free Radical Biology and Medicine. 133, 254-261 (2019).
- McCarthy, R. C., Kosman, D. J. Mechanistic analysis of iron accumulation by endothelial cells of the BBB. Biometals. 25 (4), 665-675 (2012).
- Donovan, A., et al. The iron exporter ferroportin/Slc40a1 is essential for iron homeostasis. Cell Metabolism. 1 (3), 191-200 (2005).
- Stefanova, D., et al. Endogenous hepcidin and its agonist mediate resistance to selected infections by clearing non-transferrin-bound iron. Blood. 130 (3), 245-257 (2017).
- Ramos, E., et al. Evidence for distinct pathways of hepcidin regulation by acute and chronic iron loading in mice. Hepatology. 53 (4), 1333-1341 (2011).
- Kulandavelu, S., Qu, D., Adamson, S. L. Cardiovascular function in mice during normal pregnancy and in the absence of endothelial NO synthase. Hypertension. 47 (6), 1175-1182 (2006).
- Lu, C. C., Matsumoto, N., Iijima, S. Placental transfer and body distribution of nickel chloride in pregnant mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 59 (3), 409-413 (1981).
- Gunshin, H., et al. Slc11a2 is required for intestinal iron absorption and erythropoiesis but dispensable in placenta and liver. Journal of Clinical Investigation. 115 (5), 1258-1266 (2005).
