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Biology

从mRNA中去除内部翻译起始位点，同时保留全长蛋白的表达

Published: March 16, 2022 doi: 10.3791/63405
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center

Summary

本方案描述了Gja1中的单个M213L突变，该突变保留了全长Connexin43生成，但阻止了较小的GJA1-20k内部翻译亚型的翻译。

Abstract

CRISPR-Cas9基因编辑系统基于基因组修复机制，与传统的同源重组相比，可以更快，更轻松地生成基因修饰的小鼠模型。CRISPR-Cas9系统在需要单点突变时特别有吸引力。间隙连接蛋白Connexin 43（Cx43）由基因Gja1编码，该基因具有单个编码外显子并且无法剪接。然而，Gja1不仅产生全长Cx43蛋白，而且通过称为内部翻译的过程产生多达六个N-末端截断亚型，这是内部AUG（蛋氨酸）起始位点核糖体翻译启动的结果。GJA1-20k是Cx43最常生成的截断亚型，在Gja1 mRNA的213位置的AUG密码子处引发。由于残基213发生在Cx43的最后一个跨膜结构域的末端，因此GJA1-20k实际上是Cx43的20 kDa C末端尾部，作为独立的蛋白质。先前的研究者在细胞中发现，GJA1-20k的关键作用是促进全长Cx43间隙连接半透明体到质膜的运输。为了 在体内检查这种现象，产生了具有Gja1点突变的突变小鼠，该突变用TTA（亮氨酸，M213L突变）替换残基213处的ATG（蛋氨酸）。M213L的结果是Gja1 mRNA和全长Cx43仍然产生，但Gja1-20k的翻译显着降低。本报告重点介绍如何选择限制性内切酶位点来开发一种氨基酸突变（Gja1M213L/M213L）小鼠模型。该协议描述了通过CRISPR-Cas9系统进行的转基因小鼠，以及通过结合PCR和限制性内切酶治疗进行快速基因分型。

Introduction

全长连接蛋白43（Cx43）和N-末端截断亚型GJA1-20k，由相同的GJA1 mRNA编码，但利用不同的起始密码子1来启动翻译。Cx43翻译发生在第一个AUG起始密码子，而GJA1-20k翻译发生在残基213的AUG开始。先前发现GJA1-20k对全身Cx43运输，肌动蛋白稳定和体外线粒体形态调节1，2，3具有重要作用。

为了了解GJA1-20k 在体内的作用，生成了GJA1-20k“敲除”小鼠模型，该模型保留了创建全长Cx43的能力。方法是使用CRISPR-Cas9系统将213的单个残基从蛋氨酸（M）替换为亮氨酸（L）（Gja1M213L / M213L）4。内部M至L突变大大降低了发生内部翻译的可能性，但保留了全长蛋白4的翻译和功能。由于野生型（WT）和突变等位基因具有相同的大小和几乎相同的mRNA产物，因此在小鼠中确认基因型存在相当大的困难。DNA测序可以识别突变，但对于常规使用来说太昂贵和耗时。通常，已经建立了几种更快的基因分型方法，例如实时聚合酶链反应（RT-PCR），微调序列连接，高分辨率熔解分析和四引物扩增难治性突变系统PCR（ARMS-PCR）5，6，7，8。然而，这些替代方法需要多个步骤，独特的资源和/或几个特定的引物集，可以诱导非特异性PCR产物。

该协议通过CRISPR-Cas9引入了详细的基因靶向和编辑方法，以创建单个氨基酸突变，并提出快速基因分型以确认突变。基因型鉴定涉及创造性地使用限制性内切酶，仅使用一组引物来鉴定靶基因。读者参考参考文献4 ，以观察由一个残基Gja1M213L / M213L 取代突变引起的心源性猝死的深刻电生理效应，该突变仍然产生全长蛋白质，但未能产生较小的内部翻译截断亚型。该方案将有助于使其他小鼠模型使用点突变来降低目标亚型的内部翻译，同时保留内源性全长蛋白的表达。

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Protocol

“所有动物护理和研究方案都得到了Cedars-Sinai医疗中心和犹他大学的机构动物护理和使用委员会的批准。在8-9周龄时从商业来源获得的C57BL / 6J雌性小鼠（参见 材料表）用于实验。

1. 基因靶向的准备

  1. 使用CRISPR网络算法4，9，10 选择编码M213的靶向突变位点周围的引导靶标序列（参见 材料表）。
    注意：在与GJA1编码序列相反的链中，选择了20碱基引导序列（ATTCAGAGCGAGAGACACCA），其MIT评分为11 /62，其中潜在的裂解位点位于待突变密码子下游的16个碱基之后（ATG）（图1;整个crRNA序列如 表1所示）。
  2. 合成与Cas9相互作用的crRNA和tracrRNA作为指导RNA12。
    注意：尽管引导RNA的MIT评分为62，但只有一个潜在的脱靶突变，其中四个错配距离PAM超过12个碱基。因此，该指南RNA被认为是安全的。
  3. 设计与引导序列互补的供体寡核苷酸，以引入单个氨基酸取代（ATG到TTA;M213L）分别在5'和3'侧具有60和48个碱基同源臂。
    注意：该供体寡核苷酸包括通过引入沉默突变（TCC到TCG;S217S）以避免在CRISPR同源定向修复（HDR）13 之后重新编辑，以引入预期的突变（图1 和 表1）。
  4. 使用NaCl（200 mM终浓度）沉淀10μg寡核苷酸，以尽量减少盐残留到原核显微注射缓冲液（10mM的Tris-HCl，pH 7.5; 0.1mM的EDTA和100mM的NaCl，不含精胺和亚精胺14）。
    注意：不要用70%乙醇洗涤DNA沉淀，因为沉淀可以溶解到溶液中。
  5. 混合50ng / μL供体寡核苷酸，60ng / μL crRNA / tracrRNA混合物（1：1摩尔比）（来自步骤1.2）和50ng / μL eSpCas9蛋白（参见 材料表），使CRISPR混合物最终体积为20μL（表2）。如果观察到高毒性（例如，25 ng/μL），则降低供体寡核苷酸的浓度。

2. 诱导超排卵、收获卵子、CRISPR混合物原核显微注射、囊胚筛选

注意：此过程遵循以前发布的通用协议14。

  1. 在8周龄时通过腹膜内入路向5-10只小鼠注射5IU的PMSG（怀孕母马的血清促性腺激素）（见 材料表）在100μL无菌水中，约3：00 p.m（第1天）。
  2. 在PMSG注射（第3天）后46-48小时，通过腹膜内入路将5IU的hCG（人绒毛膜促性腺激素）（见 材料表）在100μL无菌水中注射给卵子供体。与雄性种马建立1：1的繁殖。
  3. 在M2培养基中用透明质酸酶收获受精卵，在100μL M2培养基中洗涤三次，大约.m 10：00，然后保持在mWM15 或KSOM16 培养基中（第4天）（见 材料表）。
  4. 将CRISPR混合物（步骤1.3）引入通过原核显微注射14 在100μL覆盖有石蜡油的塑料培养皿中从小鼠收获的1细胞阶段胚胎中，在倒置显微镜上，在下午早些时候至傍晚使用增强对比度的光学元件（视频1）。
    注意：在后 14 - 16 小时对 1 细胞阶段胚胎进行 CRISPR 混合物的原核显微注射（ p . c . ）。注射的胚胎在5%CO2 培养箱中培养数小时，并以18-20小时p.c.手术转移到同一天早上具有交配塞的受体ICR小鼠中。
  5. 将20-30个2细胞胚胎转移到每个受体中以产生重组动物。
    注意：遵循一般方案14 或在mWM或KSOM培养基中培养这些胚胎4天，以验证效率并检查毒性。当至少三分之一的注射胚胎早期达到完全扩增的囊胚阶段并含有多种重组物时，CRISPR混合物的毒性是可以接受的。同时，超过90%的未操纵胚胎在平行培养中达到相同的囊胚阶段。按照步骤2.6-2.9进行囊肿筛查，这不是必需的，但如果愿意，可以这样做来量化HDR的成功率。
  6. 使用带有微量滴管的堵塞细移液器尖端，用2μL培养基单独拾取早期至完全扩增的囊胚到单个PCR管中（第8天; 视频 2）。
  7. 在8μL消化混合物中裂解囊胚（与步骤3.2相同;参见 材料表），并在75°C下处理10分钟，95°C处理5分钟，然后冷却至4°C储存。使用2μL裂解物作为总15μL PCR混合物中的PCR模板（步骤3）。
  8. 在用NlaIII进行限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳17 检查PCR样品的HDR的功效（步骤3-5）。
  9. 通过在创始人和随后的后代中对668 bp扩增子17 进行测序来确认靶向重组的状态，以确认突变的完整性。

3. DNA提取

注意：由于出生后2-4周左右GJA1-20k敲除小鼠猝死，因此在出生后第10天使用小鼠进行本实验4。更通用的协议也可以在先前发布的报告18之后应用。

  1. 用干净的剪刀切下1-3毫米的脚趾或尾尖，并将其转移到0.2 mL 8条PCR管中。为避免脚趾或尾巴样品中的污染，请使用预先清洁的剪刀或每只小鼠一片刀片，或在每次样品之前使用70%乙醇或10%漂白剂清洁。如果取样后尾部出血，请用纱布施加短暂的压力以阻止出血。将尾部样品储存在-20°C直至提取长达约一周。
  2. 在100μL /管中加入组织裂解溶液（参见 材料表）并充分混合，然后用台式小型离心机（室温下2，200× g ，持续10秒）旋转。确保尾部样品浸没在溶液中。
  3. 将管子设置到由以下程序设置的热循环仪上;75°C持续10分钟（组织裂解），95°C持续5分钟（灭活）和4°C（保温）。如果不能立即进行PCR，则将组织裂解物在4°C下储存长达一周。

4. 通过PCR进行DNA扩增

  1. 将含有5μL无核酸酶H2O，0.75μL10μM正向和反向引物以及7.5μLPCR预混液（参见 材料表）的PCR溶液制备到新的PCR管中（引物序列见 表1 ）。如果有多个样品，则将内容物缩放至每管等分14μL。
  2. 向步骤3.1中制备的PCR溶液中加入1μL组织裂解物。注意不要碰到尾巴。
  3. 充分混合并用台式小型离心机（室温下2，200× g ，持续10秒）旋转。
  4. 将管子设置到由以下程序设置的热循环仪上。将PCR产物在4°C下储存1-2个月或在-20°C下储存〜1年。
    注意：95°C 3分钟（步骤1，初始变性），95°C15秒（步骤2，变性），60°C15秒（步骤2，退火），72°C45秒（步骤2，延伸），重复步骤235个周期，72°C10分钟（步骤3，最终延伸）和4°C（步骤4，保持）。

5. 与限制性内切酶一起孵育

  1. 制备含有7μL无核酸酶H2O，2μL10x CutSmart缓冲液和1μLNlaIII限制性内切酶的酶溶液（参见 材料表）。如果有多个样品，则将每种含量相乘以制成混合物，并等分试样每管10μL。
  2. 每管向酶溶液中加入步骤3中获得的10μLPCR产物。
  3. 充分混合并用台式小型离心机（室温下2，200× g ，持续10秒）旋转。
  4. 将管子设置到由以下程序设置的热循环仪或加热块上。将产品在4°C孵育后在-2°C下孵育1-2个月或〜1年。
    注意：37°C保存16小时（至少2小时;孵育时间短可能导致裂解不足）和4°C保持。

6. DNA条带检测

  1. 制备含有DNA凝胶染色剂的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。
    1. 在50mL 1x TAE缓冲液中加入0.75g琼脂糖，然后在微波炉中混合并加热，直到琼脂糖完全溶解。冷却后，加入5μLDNA染色剂并轻轻混合。
    2. 倒入凝胶模具（每个模具25 mL）中，让凝胶固化。为了获得更好的分辨率和分离，根据需要将琼脂糖浓度提高到2.5%-4%。
  2. 将10μL消化的PCR产物加载到孔中。如有必要，混合6x上样缓冲液。
  3. 用100 V电泳凝胶35分钟。
    注意：这些参数可能需要优化。
  4. 紫外光（302 nm 波长）下的图像。

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Representative Results

CRISPR/ Cas9基因编辑系统在小鼠10号染色体上分别产生ATG至TTA突变和56，264，279至56，264，281和56，264，291至56，264，293的ATG至TCG突变和TCG的沉默TCC突变，或在Gja1 mRNA上分别产生869至871和881至883的TCC至TCG突变。这些突变导致GJA1蛋白上的蛋氨酸213到亮氨酸（M213L）突变，并且TTC到TTG突变破坏了附近的PAM序列以避免不需要的基因版本（图1）。突变的细节在上一份报告4中进行了描述。

为了分析正确的基因型，PCR产物需要在琼脂糖凝胶电泳之前通过限制性内切酶“NlaIII”消化（图2，步骤4）。如图 2A所示，野生型（WT）等位基因PCR产物将被切割成两种不同的碱基对产物（227 bp和441 bp）。相比之下，突变等位基因PCR产物将完整（668 bp），因为突变缺乏NlaIII识别位点（图2B）。一般的琼脂糖电泳可以使用消化的PCR产物进行（步骤5）。琼脂糖凝胶中的特定条带指示每种基因型（WT，野生型;呵呵，杂合子;嗯，纯合子）。由于上述限制，每种基因型导致几个不同大小的条带（图2C）。这些波段将是WT中的两个波段（227 bp和441 bp），Het中的三个波段（227 bp，441 bp和668 bp），以及Hm中的一个波段（668 bp）。根据使用单一限制性内切酶的凝胶成像，可以区分小鼠的适当基因型。

在我们的实验中，最初生产了二十一个创始人，其中九个是杂合子或马赛克动物。九位创始人中有两位在长大到繁殖年龄之前就去世了，这很可能是由于双等位基因突变体细胞的高内涵嵌合。随后通过向野生型C57BL / 6J小鼠回交至少两代，从其余七名创始人中建立了两个独立的突变系。由于靶向突变在纯合时是致命的，因此我们必须将该品系维持为杂合子，以进一步稀释可能的脱靶突变。纯合子实验动物是通过杂交后代产生的。

值得注意的是，将供体寡核苷酸注射到胚胎中时，供体寡核苷酸的胚胎毒性相对较高，为50ng / μL。然而，供体浓度为12.5ng / μL并未诱导所得幼崽的靶向重组。此外，还发现寡核苷酸的乙醇沉淀有助于去除污染物，并允许诱导高效，有针对性的基因组编辑。请注意，用70%乙醇洗涤DNA沉淀将沉淀溶解到溶液中。因此，以200mM终浓度使用NaCl沉淀10μg寡核苷酸，以尽量减少盐残留到原核显微注射缓冲液中。尝试使用50或25ng / μL供体寡核苷酸与乙醇沉淀进行囊胚分析的测试注射。每种病症的成功率为76.9%（13个样品中的10个，50ng / μL）和25.0%（12个样品中的3个，25ng / μL）（图3A-C）。虽然50 ng / μL寡核苷酸与乙醇沉淀仍然有些毒性，但需要注射许多卵子，并且重组体以很高的成功率生产。因此，最终向50 ng/μL供体寡核苷酸注射乙醇沉淀，获得成功率为50.0%的创始动物（32只幼崽中有16只具有重组，包括21例存活和11例出生后死亡）。使用两种具有均匀突变或单allelic或相同突变的种系传播的创始动物，通过测序确认稳定传播来建立独立的系。人们的共识是，与野生型动物进行两代的反向杂交并使用增强保真度的Cas9蛋白可以消除主要的脱靶事件。此类事件的数量在统计学上与从头突变的背景速率19，20没有区别。

具有不需要的基因型（野生型或不正确的重组体）用于实验的动物，并在研究结束时通过CO2 吸入安乐死，然后根据IACUC协议进行宫颈脱位。

Figure 1
图1：CRISPR / Cas9基因靶向的示意图。 （A）同源物重组的靶向序列。序列之间显示单字母氨基酸。彩色高光表示同源臂（灰色），突变密码子（绿色），PAM序列（橙色）和gRNA靶序列（蓝色）。蓝色箭头表示gRNA。NlaIII 限制性站点由虚线下划线标出。（B）WT和突变等位基因以及供体寡核苷酸的点突变示意图序列导致M213L突变。TCC to TCG 是一种无声突变，用于破坏不需要的 PAM。 请单击此处查看此图的放大版本。

Figure 2
图2：WT的PCR产物和限制性位点以及突变等位基因的示意图 （A，B）PCR方案和NlaIII的消化。引物扩增突变位点周围668 bp的Gja1 DNA。WT等位基因PCR产物被NlaIII消化成两种不同尺寸。相反，突变等位基因不被消化并保持完整的PCR产物。（C）琼脂糖凝胶的代表图像表示WT和突变等位基因。每种小鼠基因型都有特定的条带大小;WT（通道 1、3 和 5）、Het（通道 2）和 Hm（通道 4）。 请点击此处查看此图的大图。

Figure 3
图3：CRISPR混合物中两种不同剂量的供体寡核苷酸的重组效率。（A）注射不同剂量（25或50 ng / μL）供体寡核苷酸的morulae或囊胚的基因分型结果，显示野生型（WT;泳道#10，12和14），杂合/镶嵌（het/mosaic;泳道#1，2，3，6，8，9， 11和13），纯合子（hom;通道#4和5）或未放大（通道#7）。野生型正对照和H2O作为负对照在17号和18号车道之间加载。（B-D）饼图代表了两种不同剂量的供体寡核苷酸（B，C）和注射50 ng / μL供体寡核苷酸（D）的创始动物的CRISPR混合物的重组效率。请注意，在出生的32只动物中，有11只被母亲杀死或在断奶前死亡。在PCR中未能扩增的样品被排除在重组效率的计算中。所有样品的个体基因型率见表3和表4。请点击此处查看此图的大图。

名字 序列 评论
铬核酸 5' 奥卡加加加卡卡古
UUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 3'		 下划线表示 CRSPR 目标序列
寡核苷酸多纳脱氧核糖核酸 5' CCCCACCAGGTGACTGTTCCTCTCACG
TCCCACGGAGAAAACCATCTCTTCATCT
TACTGGTGGTGTCGTTGGTGTCTCTCTCTCTCTCT
GAATATCATTGAGCTCTCTTCTC 3'		 下划线表示突变的密码子。TTA 突变前的拳头 60 bp 和 TCG 突变后的 48 bp 是同源臂
基因分型引物前驱 5' TGGGATTGAAGAACGGCA 3'
基因分型引物反向 5' CCACGATAGCTAAGGGCTGG 3'

表 1：序列信息。

元件 库存解决方案 量 最终浓度
供体寡核苷酸 1μg/μL 无Rna酶 H2O 1.0 μL 50 纳克/微升
GJA1 crRNA 1μg/μL 无Rna酶 H2O 0.4 微升 20 纳克/微升
tracrRNA 1μg/μL 无Rna酶 H2O 0.8 微升 40 纳克/微升
eSpCas9 蛋白 1μg/μL 无Rna酶 H2O 1.0 μL 50 纳克/微升
无RNA酶注射缓冲液 0.1 mM 乙二胺四乙酸 pH 8.0 16.8 微升
10 mM 三盐酸 pH 7.5
100 mM 氯化钠
总体积 20.0 微升

表2：CRISPR混合物的配方。

通道 # （图 3） 供体寡核苷酸 地位 未放大 野生型 Het/mosaic 磡 注意
1 50纳克/微升 桑葚胚 Het/mosaic 删除
2 50纳克/微升 桑葚胚 Het/mosaic
3 50纳克/微升 桑葚胚 Het/mosaic
4 50纳克/微升 桑葚胚 磡
5 50纳克/微升 桑葚胚 磡
6 50纳克/微升 桑葚胚 Het/mosaic 删除
7 50纳克/微升 桑葚胚 不适用
8 50纳克/微升 桑葚胚 Het/mosaic
9 50纳克/微升 桑葚胚 Het/mosaic
10 50纳克/微升 桑葚胚 野生型
11 50纳克/微升 桑葚胚 Het/mosaic
12 50纳克/微升 桑葚胚 野生型
13 50纳克/微升 桑葚胚 Het/mosaic 插入
14 50纳克/微升 桑葚胚 野生型
- 3/13 (23.1%) 8/13 (61.5%) 2/13 (15.4%)
15 25纳克/微升 桑葚胚 不适用
16 25纳克/微升 桑葚胚 不适用
17 25纳克/微升 桑葚胚 不适用
18 25纳克/微升 桑葚胚 不适用
19 25纳克/微升 桑葚胚 野生型
20 25纳克/微升 桑葚胚 不适用
21 25纳克/微升 桑葚胚 野生型
22 25纳克/微升 桑葚胚 野生型
23 25纳克/微升 囊胚 不适用
24 25纳克/微升 囊胚 野生型
25 25纳克/微升 囊胚 Het/mosaic
26 25纳克/微升 囊胚 野生型
27 25纳克/微升 囊胚 不适用
28 25纳克/微升 囊胚 野生型
29 25纳克/微升 囊胚 野生型
30 25纳克/微升 囊胚 Het/mosaic 插入/删除
31 25纳克/微升 囊胚 野生型
32 25纳克/微升 囊胚 Het/mosaic 插入
33 25纳克/微升 囊胚 野生型
- 9/12 (75.0%) 3/12 (25.0%) 0 (0.0%)

表3：Morula和Bladocyst的基因分型结果。

动物# 供体寡核苷酸 地位 未放大 野生型 Het/mosaic 磡 注意
d1 50纳克/微升 死去的小狗 野生型
d2 50纳克/微升 死去的小狗 Het/mosaic
d3 50纳克/微升 死去的小狗 Het/mosaic 删除
d4 50纳克/微升 死去的小狗 野生型
d5 50纳克/微升 死去的小狗 Het/mosaic
d6 50纳克/微升 死去的小狗 野生型
d7 50纳克/微升 死去的小狗 Het/mosaic
d8 50纳克/微升 死去的小狗 Het/mosaic
34 50纳克/微升 活小狗 Het/mosaic
35 50纳克/微升 活小狗 野生型
36 50纳克/微升 活小狗 野生型
37 50纳克/微升 活小狗 Het/mosaic 用作独立线路
38 50纳克/微升 活小狗 野生型
39 50纳克/微升 活小狗 野生型
40 50纳克/微升 活小狗 野生型
41 50纳克/微升 活小狗 Het/mosaic
42 50纳克/微升 活小狗 野生型
43 50纳克/微升 活小狗 野生型
44 50纳克/微升 活小狗 野生型
45 50纳克/微升 活小狗 野生型
d1 50纳克/微升 死去的小狗 磡
d2 50纳克/微升 死去的小狗 野生型
d3 50纳克/微升 死去的小狗 Het/mosaic
46 50纳克/微升 活小狗 Het/mosaic
47 50纳克/微升 活小狗 Het/mosaic 插入
48 50纳克/微升 活小狗 Het/mosaic 插入
49 50纳克/微升 活小狗 Het/mosaic
50 50纳克/微升 活小狗 野生型
51 50纳克/微升 活小狗 Het/mosaic 用作独立线路
52 50纳克/微升 活小狗 野生型
53 50纳克/微升 活小狗 Het/mosaic 插入/删除
54 50纳克/微升 活小狗 野生型
16/32 (50.0%) 15/32 (46.9%) 1/32 (3.1%)

表4：来自创始动物的基因分型结果。

视频1：向胚胎注射CRISPR。 将CRISPR混合物注射到步骤2.4中描述的1细胞阶段胚胎中。 请点击此处下载此视频。

视频2：囊胚拾取。 显示囊胚在步骤2.6中拾取的代表性视频。 请点击此处下载此视频。

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Discussion

基因修饰小鼠模型是了解基因功能的常用方法。然而，由于GJA1-20k内部翻译的同种型是从与全长Cx43相同的 Gja1 mRNA翻译而来的，因此设计了一种创造性的策略来保留全长Cx43表达，同时抑制GJA1-20k表达。该方法基于GJA1-20k内部起始密码子的突变。通过单点突变，M213在 Gja1 mRNA上切换为L，成功抑制GJA1-20k表达，但保留了全长Cx43表达4。

然而，单个内部翻译起始位点的点突变带来了另一个困难：确定小鼠基因型。单个残基取代太小，无法制成特定的引物。此外，WT和突变等位基因具有相同的碱基对。在基因分型方案中又增加了一个步骤来解决这些问题。由于GJA1-20k（靶向突变位点）的起始密码子被限制性内切酶NlaIII识别，因此NlaIII未识别的位点发生了突变（图1;CATG 到 CTTA）。此外，用于生成PCR产物的引物被设计为没有任何其它NlaIII合适的位点。通过在限制性内切酶中添加酶消化步骤，为点突变小鼠品系建立了适当的基因分型方案。通常，酶消化通过短时间孵育完成（在37°C下0.5-2.0小时）;建议过夜孵育（约16小时）以完全消化整个PCR产物。靶序列中突变的引入导致WT和突变等位基因之间的错误识别。因此，在本方案中，建议过夜孵育以充分消化，除非所选的限制性内切酶具有星形活性21。

目前的项目旨在通过将ATG（蛋氨酸）更改为TTA（亮氨酸）来破坏第二个翻译起始位点。NlaIII是一种方便的快速筛选的限制性内切酶，因为它可以在靶向位点识别CATG。胞嘧啶（C）通常与翻译起始位点之前的KOZAK序列相关。NcoI（C/ CATGG）和NDEI（CA/TATG）是该地区用于筛选的其他多功能限制性内切酶，如果需要使用替代密码子来创建/删除这些限制性位点。如果引入沉默突变对于基于限制性的基于位点的筛选是不容许的，则需要对单个样本进行测序22，23。在这个项目中，有针对性的重组非常有效。

这个M213L突变小鼠系使我们能够分析GJA1-20k的功能。最近，使用这种小鼠线，发现GJA1-20k对于心脏4中全长Cx43间隙连接的运输和形成至关重要。有趣的是，纯合子M213L突变（Gja1M213L/M213L）由于不能产生GJA1-20k，总是导致出生后2-4周猝死，因为相应的心脏不会在心脏插层盘上形成间隙连接。相比之下，杂合子M213L突变显示接近正常的心脏功能，并且小鼠的寿命与WT动物4的寿命相似。先前 的体外 研究也表明，M213L突变破坏了适当的间隙连接形成1。此外，这种间隙连接破坏通过外源性GJA1-20k转染来挽救。基于基底条件4 下杂合子M213L突变小鼠心脏的正常间隙连接形成和 体外 研究1，可以得出结论，具有M213L突变的全长Cx43作为间隙连接蛋白保持适当的功能。

除了GJA1-20k在Cx43运输中的重要作用外，GJA1-20k还富含线粒体外膜，诱导保护性线粒体裂变和生物发生3，24，25。在线粒体功能方面，具有GJA1-20k（Gja1M213L / WT）杂合突变的小鼠对缺血/再灌注损伤具有极高的敏感性。当暴露于缺血/再灌注时，成年Gja1M213L / WT 小鼠具有比WT对应物更大的梗塞尺寸和更多的线粒体破坏25。

总之，含有M213L突变的新小鼠品系有助于分析内部翻译的GJA1-20k。需要注意的是，全长Cx43和较小的GJA1-20k在所有哺乳动物器官系统中都有表达。未来的研究预计将探索心外GJA1-20k的作用。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

该项目得到了美国国立卫生研究院（R01HL152691，R01HL138577和R01HL159983）对RMS的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL 8-Strip PCR tube Thomas Scientific 1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0 Invitrogen 15575-038 For pronuclear micorinjection buffer
10x CutSmart buffer New England Biolabs B7204S Digestion buffer for NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5 Invitrogen 15567-027 For pronuclear micorinjection buffer
50x TAE Buffer Invitrogen 24710-030
96-well Thermal cycler Applied Biosystems Model # 9902
Agarose Sigma-Aldrich A9539
C57BL/6J The Jackson Laboratory 664 mouse strain
Chemidoc MP imaging system Bio-rad To take gel image by 302 nm UV light
eSpCas9 protein MilliporeSigma ESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x) New England Biolabs B7024S Loading buffer for electrophoresis
Gloves
hCG (human chorionic gonadotropin) MilliporeSigma 23-073-425G
Hyaluronidase MilliporeSigma H3884-100MG
Image Lab software Bio-rad To analyze gel image
Inverted stereo microscope whit plasDIC Zeiss Axiovert A1
KAPA Mouse Genotyping Kits Roche Diagnostics KK7352 For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix
KSOM LifeGlobal ZEKS-050 embryo culture medium
Lab coart
M2 medium MilliporeSigma MR015D
NlaIII New England Biolabs R0125S To digest PCR product
Nuclease-Free Water Ambion AM9937 To dilute reagents
Paraffin oil Nacalai USA 2613785
Plugged 20 μL fine pipette tip FisherScientific 02-707-171 To pick up blastocytes
PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) ProSpec-Tany HOR-272
Sodium Chloride Invitrogen AM9760G For pronuclear micorinjection buffer
SYBR safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102 To detect bands in gel
tracrRNA Dharmacon U-002000-120 Guid RNA

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References

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生物学，第181期，基因修饰，基因编辑，CRISPR-Cas9，转基因小鼠模型，点突变，基因分型，限制性内切酶
从mRNA中去除内部翻译起始位点，同时保留全长蛋白的表达
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Shimura, D., Hunter, J., Katsumata, M., Shaw, R. M. Removal of an Internal Translational Start Site from mRNA While Retaining Expression of the Full-Length Protein. J. Vis. Exp. (181), e63405, doi:10.3791/63405 (2022).

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