Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מוטציה אחת M213L ב- Gja1 השומרת על דור Connexin43 באורך מלא אך מונעת תרגום של איזופורם קטן יותר של GJA1-20k שתורגם באופן פנימי.
Abstract
מערכת עריכת הגנים CRISPR-Cas9, המבוססת על מנגנוני תיקון גנום, מאפשרת ליצור מודלים של עכברים שעברו שינוי גנטי במהירות ובקלות רבה יותר ביחס לשילוב ההומולוגי המסורתי. מערכת CRISPR-Cas9 אטרקטיבית במיוחד כאשר נדרשת מוטציה של נקודה אחת. חלבון צומת הפערים, Connexin 43 (Cx43), מקודד על ידי הגן Gja1, שיש לו אקסון קידוד יחיד ולא ניתן לחבר אותו. עם זאת, Gja1 מייצר לא רק חלבון Cx43 באורך מלא אלא עד שישה איזופורמים חתוכים N-טרמינוס על ידי תהליך המכונה תרגום פנימי, תוצאה של חניכת תרגום ריבוזומלי באתרי התחלה פנימיים AUG (מתיונין). GJA1-20k הוא האיזופורם החתוך הנפוץ ביותר שנוצר של Cx43 שיזם בקודון AUG במיקום 213 של Gja1 mRNA. מכיוון שאריות 213 מתרחשת בסוף תחום transmembrane האחרון של Cx43, GJA1-20k הוא למעשה זנב 20 kDa C-terminus של Cx43 כחלבון עצמאי. חוקרים קודמים זיהו, בתאים, כי תפקיד קריטי של GJA1-20k הוא להקל על סחר של hemichannels צומת פער Cx43 באורך מלא לקרום הפלזמה. כדי לבחון תופעה זו ב- vivo, נוצר עכבר מוטנטי עם מוטציה נקודתית Gja1 המחליף את ה- ATG (מתיונין) בשאריות 213 עם TTA (לאוצין, מוטציה M213L). התוצאה של M213L היא כי Gja1 mRNA ו Cx43 באורך מלא עדיין נוצרים, עדיין התרגום של Gja1-20k מופחת באופן משמעותי. דו"ח זה מתמקד בבחירת אתר אנזימי ההגבלה לפתח מודל עכבר מוטציה אחת של חומצת אמינו (Gja1M213L/M213L). פרוטוקול זה מתאר עכברים מהונדסים גנטית על ידי מערכת CRISPR-Cas9 וגנוטיפינג מהיר על ידי שילוב של PCR וטיפולי אנזימי הגבלה.
Introduction
קונקסין 43 (Cx43) באורך מלא ואיזופורם טרמינל N-terminus, GJA1-20k, מקודד על ידי אותו GJA1 mRNA אך משתמשים בקודוני התחלה שונים1 כדי ליזום תרגום. תרגום Cx43 מתרחש בקודון ההתחלה הראשון של AUG, בעוד שתרגום GJA1-20k יוזם ב- AUG בשאריות 213. בעבר נמצא כי GJA1-20k יש תפקידים חיוניים עבור סחר Cx43 באורך מלא, ייצוב actin, ורגולציה של מורפולוגיה מיטוכונדריאלית במבחנה 1,2,3.
כדי להבין את התפקיד של GJA1-20k ב vivo, GJA1-20k "לדפוק החוצה" מודל העכבר נוצר ששומר על היכולת ליצור Cx43 באורך מלא. הגישה הייתה להשתמש במערכת CRISPR-Cas9 כדי להחליף את השאריות הבודדות ב-213 ממתיונין (ז) ללאוצין (L) (Gja1M213L/M213L)4. מוטציה פנימית M ל- L מקטינה באופן דרמטי את הסבירות לתרגום פנימי המתרחש אך שומרת על התרגום והתפקוד של חלבון באורך מלא4. מכיוון שלסוג הפראי (WT) ולאלל שעבר מוטציה יש גדלים זהים ומוצרי mRNA כמעט זהים, קיים קושי ניכר באישור גנוטיפ בעכברים. ריצוף דנ"א יכול לזהות את המוטציה, אך הוא יקר מדי וגוזל זמן רב מדי לשימוש שגרתי. באופן כללי, הוקמו מספר שיטות גנוטיפינג מהיר יותר, כגון תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR), מיני-קשירה-קשירה, ניתוח היתוך ברזולוציה גבוהה, ומערכת מוטציה עקשן הגברה טטרה-פריימר PCR (נשק-PCR)5,6,7,8. עם זאת, שיטות חלופיות אלה דורשות שלבים מרובים, משאבים ייחודיים ו/או מספר ערכות פריימר ספציפיות אשר יכולות לגרום למוצרי PCR שאינם ספציפיים.
פרוטוקול זה מציג גישה מפורטת של פילוח ועריכה של גנים על ידי CRISPR-Cas9 כדי ליצור מוטציה אחת בחומצת אמינו, וגנוטיפינג מהיר מוצג כדי לאשר את המוטציה. זיהוי גנוטיפ כרוך בשימוש יצירתי באנזימי הגבלה המשתמשים רק בערכה אחת של פריימרים כדי לזהות את גן היעד. הקוראים מופנים Reference4 כדי לבחון את ההשפעה האלקטרופיזיולוגית העמוקה של מוות לבבי פתאומי הנגרמת על ידי שאריות אחת Gja1M213L / M213L מוטציה החלפת אשר עדיין מייצר חלבון באורך מלא עדיין לא מצליח לייצר איזופורם חיתוך קטן יותר מתורגם פנימית. פרוטוקול זה יסייע להפוך מודלים עכברים אחרים להשתמש מוטציה נקודתית כדי להקטין את התרגום הפנימי של איזופורם של עניין תוך שמירה על הביטוי של חלבון אנדוגני באורך מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל פרוטוקולי הטיפול והלימוד בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש במרכז הרפואי סידרס-סיני ובאוניברסיטת יוטה. עכברות C57BL/6J שהתקבלו ממקורות מסחריים בגיל 8-9 שבועות (ראו טבלת חומרים) שימשו לניסויים.
1. הכנה למיקוד גנים
- בחר את רצף יעד המדריך סביב אתר המוטציה הממוקד קידוד M213 באמצעות אלגוריתם האינטרנט CRISPOR 4,9,10 (ראה טבלת חומרים).
הערה: נבחר רצף מדריך בן 20 בסיסים (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), בגדיל הנגדי מרצף הקידוד של GJA1, עם ציון MIT11 מתוך 62 שבו אתר המחשוף הפוטנציאלי ממוקם לאחר 16 בסיסים במורד הזרם של הקודון שיש לעבור מוטציה (ATG) (איור 1; רצף crRNA כולו מוצג בטבלה 1). - לסנתז את crRNA ו tracrRNA אינטראקציה עם Cas9 כמדריך RNA12.
הערה: למרות שציון MIT של RNA המדריך הוא 62, יש רק מוטציה פוטנציאלית אחת מחוץ למטרה עם ארבעה אי-התאמות במרחק של יותר מ-12 בסיסים מה-PAM. לכן, מדריך זה RNA נחשב בטוח. - עיצוב אוליגו תורם משלים לרצף המדריך כדי להציג תחליף חומצת אמינו אחת (ATG ל- TTA; M213L) עם 60 ו-48 בסיסים זרועות הומולוגיות בצדדים 5'-ו-3', בהתאמה.
הערה: אוליגו תורם זה כולל מוטציה נקודתית לשיבוש של PAM (AGG ל- ACG) על ידי החדרת מוטציה שקטה (TCC ל- TCG; S217S) כדי להימנע מעריכה מחדש לאחר תיקון הומולוגיה (HDR)13 בהוראת CRISPR להכנסת המוטציות המיועדות (איור 1 וטבלה 1). - השתמש NaCl (200 mM ריכוז סופי) כדי לזרז 10 מיקרוגרם של אוליגוס כדי למזער את נשיאת מלח לתוך מאגר microinjection pronuclear (10 מ"מ של טריס-HCl, pH 7.5; 0.1 מ"מ של EDTA, ו 100 מ"מ של NaCl ללא זרע וזרע14).
הערה: אין לשטוף את גלולה ה- DNA עם 70% אתנול כמו גלולה ניתן להמיס לתוך הפתרון. - יש לערבב 50 ננוגרם/μL של אוליגו תורם, 60 ננוגרם/μL של תערובת crRNA/tracrRNA (יחס טוחנת של 1:1) (משלב 1.2) ו-50 ננוגרם/μL של חלבון eSpCas9 (ראו טבלת חומרים) להכנת תערובת CRISPR בנפח הסופי 20 μL (טבלה 2). להקטין את הריכוז של אוליגו התורם אם רעילות גבוהה הוא ציין (למשל, 25 ng/μL).
2. אינדוקציה של superovulation, קצירת ביצים, מיקרו-חדיר פרונוקלארי של תערובת CRISPR, והקרנת בלסטוציסט
הערה: הליך זה פועל בהתאם לפרוטוקול כללי14 שפורסם בעבר.
- הזרקו 5 IU של PMSG (גונדוטרופין בסרום של סוסה בהריון) (ראה טבלת חומרים) ב 100 μL של מים סטריליים ל 5-10 עכברים בגיל 8 שבועות על ידי גישה תוך-אפריטונית בסביבות 3:00 p.m. (יום 1).
- הזרקת 5 IU של hCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי) (ראה טבלת חומרים) ב 100 μL של מים סטריליים לתורמי הביציות על ידי גישה תוך-פריטטונית 46-48 שעות לאחר הזרקת PMSG (יום 3). להגדיר 1:1 רבייה עם זכרי הרבעה.
- קציר ביצים מופרות במדיום M2 עם היאלורונידז, לשטוף שלוש פעמים ב 100 μL של M2 בינוני סביב 10:00 a.m., ולאחר מכן לשמור mWM15 או KSOM16 בינוני (יום 4) (ראה טבלת חומרים).
- הציגו את תערובת CRISPR (שלב 1.3) לעוברים בשלב של תא אחד שנקטפו מהעכברים על ידי מיקרו-ג'קציה פרונוקלארית14 ב-100 μL של M2 המכוסה בשמן פרפין בצלחת פלסטיק במיקרוסקופ הפוך עם אופטיקה משפרת ניגודיות בשעות אחר הצהריים המוקדמות עד שעות אחר הצהריים המאוחרות (וידאו 1).
הערה: microinjection pronuclear של תערובת CRISPR בוצע על עוברי שלב תא אחד ב 14-16 שעות פוסט-קויטום (p.c.). העוברים המוזרקים היו מתורבתים בחממה של 5% CO2 במשך כמה שעות והועברו בניתוח במהירות של 18-20 שעות p.c. לעכברי ICR נמען שהיה להם תקע הזדווגות באותו בוקר. - העבר 20-30 עוברים דו-תאיים לכל נמען כדי לייצר בעלי חיים רקומביננטיים.
הערה: בצע את הפרוטוקול הכללי14 או תרבות העוברים האלה במדיום mWM או KSOM במשך 4 ימים כדי לאמת את היעילות ולבחון רעילות. רעילות של תערובת CRISPR מקובלת כאשר לפחות שליש מהעוברים המוזרקים מגיעים מוקדם לשלב הבלסטוציסט המורחב במלואו עם רקומביננטים מרובים ביניהם. יחד עם זאת, יותר מ -90% מהעוברים הלא מנוהלים מגיעים לאותו שלב בלסטוציסט בתרבות מקבילה. בצע את השלב 2.6-2.9 עבור הקרנת blastcyst אשר אינו חיוני אבל ניתן לעשות אם עדיף לכמת את שיעור ההצלחה של HDR. - בנפרד להרים מוקדם עד מורחב מלא blastocysts עם 2 μL של מדיום תרבות באמצעות קצה פיפטה בסדר מחובר עם micropipetter לתוך צינורות PCR יחיד (יום 8; וידאו 2).
- Lyse blastocysts ב 8 μL של תערובת עיכול (זהה לשלב 3.2; ראה טבלת חומרים) ולעבד ב 75 °C (75 °F) במשך 10 דקות, 95 °C (95 °F) במשך 5 דקות, ולאחר מכן להתקרר עד 4 °C (60 °F) לאחסון. השתמש 2 μL של lysate כתבנית עבור PCR בתערובת כוללת של 15 μL PCR (שלב 3).
- בדוק את היעילות של HDR על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose17 של דגימות PCR בעקבות עיכול הגבלה עם NlaIII (שלב 3-5).
- אשר את הסטטוס של רקומבינציה ממוקדת על ידי ריצוף 668 bp amplicon17 במייסדים וצאצאים הבאים כדי לאשר את שלמות המוטציה.
3. מיצוי דנ"א
הערה: עכברים ביום שלאחר הלידה 10 שימשו לניסוי זה עקב מוות פתאומי של עכבר נוקאאוט GJA1-20k סביב 2-4 שבועות לאחר הלידה4. ניתן גם להחיל פרוטוקול כללי יותר בעקבות דוח18 שפורסם בעבר.
- חותכים 1-3 מ"מ של הבוהן או קצה הזנב עם מספריים נקיות ולהעביר אותו לצינור PCR 8 פסים 0.2 מ"ל. כדי למנוע זיהום בין דגימות הבוהן או הזנב, השתמש במספריים מנוקים מראש או להב אחד לכל עכבר או לנקות לפני כל מדגם באמצעות 70% אתנול או 10% אקונומיקה. אם הזנב מדמם לאחר הדגימה, להחיל לחץ קצר עם גזה כדי לעצור את הדימום. לאחסן את דגימות הזנב ב -20 °C (50 °F) עד החילוץ עד כשבוע.
- הוסף פתרון תמיסת תמוגה רקמה (ראה טבלת חומרים) ב 100 μL / צינור ולערבב היטב, ואחריו ספין למטה עם מיני צנטריפוגה שולחן (2,200 x גרם עבור 10 s בטמפרטורת החדר). ודא שדגימות הזנב שקועות בפתרון.
- הגדר את הצינורות על מחזור תרמי שנקבע על ידי התוכנית הבאה; 75 °C (10 °F) במשך 10 דקות (תמוגה רקמות), 95 °C (95 °F) במשך 5 דקות (איון) ו 4 °C (מחזיק). לאחסן את lysate הרקמה ב 4 °C (65 °F) עד שבוע אם PCRs לא ניתן לבצע באופן מיידי.
4. הגברת DNA על ידי PCR
- הכן פתרון PCR המכיל 5 μL של H2O ללא נוקלאז, 0.75 μL של 10 מיקרומטר קדימה ואחורה פריימרים, ו 7.5 μL של תערובת מאסטר PCR (ראה טבלת חומרים) לכל מדגם לתוך צינור PCR חדש (ראה טבלה 1 עבור רצפי פריימר). אם יש כמה דוגמאות, קנה מידה תוכן aliquot 14 μL לכל צינור.
- הוסף 1 μL של lysate הרקמה לפתרון PCR מוכן בשלב 3.1. תיזהר לא לגעת בזנב.
- מערבבים היטב ומסתובבים עם מיני צנטריפוגה על השולחן (2,200 x גרם ל-10 שניות בטמפרטורת החדר).
- הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי שנקבע על ידי התוכנית המפורטת להלן. אחסן את מוצרי PCR בטמפרטורה של 4 °C (65 °F) למשך 1-2 חודשים או ~ שנה אחת ב- -20 °C (60 °F).
הערה: 95 °C (שלב 3 דקות, שלב 1, Denaturation ראשוני), 95 °C (שלב 15 s (שלב 2, Denaturation), 60 °C (60 °F עבור 15 s (שלב 2, חישול), 72 °C עבור 45 s (שלב 2, הרחבה), חזור על שלב 2 במשך 35 מחזורים, 72 °C (7 °C במשך 10 דקות (שלב 3, הרחבה סופית) ו 4 °C (שלב 4, החזקה).
5. דגירה עם אנזים הגבלה
- הכן את פתרון האנזים המכיל 7 μL של H2O ללא נוקלאז, 2 μL של חיץ CutSmart 10x, ו 1 μL של אנזים הגבלת NlaIII (ראה טבלת חומרים). אם יש כמה דוגמאות, להכפיל כל תוכן כדי להפוך את התערובת aliquot 10 μL לכל שפופרת.
- הוסף 10 μL של מוצר PCR המתקבל בשלב 3 לתמיסת האנזים לכל צינור.
- מערבבים היטב ומסתובבים עם מיני צנטריפוגה על השולחן (2,200 x גרם ל-10 שניות בטמפרטורת החדר).
- הגדר את הצינורות על רוכב אופניים תרמי או בלוק חום שנקבע על ידי התוכנית המפורטת להלן. לאחסן את המוצר לאחר הדגירה ב 4 °C (4 °F) במשך 1-2 חודשים או ~ 1 שנה ב -20 °C (60 °F).
הערה: 37 °C (16 °F) עבור 16 שעות (לפחות 2 שעות; זמן דגירה קצר עלול לגרום מחשוף לא מספיק) ו 4 °C (4 °F) עבור החזקה.
6. זיהוי רצועת DNA
- הכן ג'ל 1.5% agarose המכיל כתם ג'ל DNA עבור אלקטרופורזה.
- מוסיפים 0.75 גרם agarose ב 50 מ"ל של חיץ TAE 1x ואחריו לערבב ולחמם במיקרוגל עד agarose מתמוסס לחלוטין. לאחר הקירור, מוסיפים 5 μL של כתם DNA ומערבבים בעדינות.
- יוצקים לתבנית הג'ל (25 מ"ל לתבנית) ומניחים לג'ל להתמצק. כדי להשיג רזולוציה והפרדה טובה יותר, להגדיל את ריכוז agarose ל 2.5%-4% לפי הצורך.
- טען 10 μL של מוצר PCR מעוכל לבאר. יש לערבב מאגר טעינה 6x, במידת הצורך.
- הפעל את הג'ל עם 100 V במשך 35 דקות.
הערה: ייתכן שפרמטרים אלה יזדקקו למיטוב. - תמונה תחת אור UV (אורך גל של 302 ננומטר).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מערכת עריכת הגנים CRISPR/Cas9 מייצרת מוטציה ATG ל- TTA ומוטציה שקטה של TCC ל- TCG ב-56,264,279 עד 56,264,281 וב-56,264,291 עד 56,264,293 בכרומוזום עכבר 10, או ב-869 עד 871 ו-881 עד 883 ב-Gja1 mRNA, בהתאמה. מוטציה זו גורמת למוטציה של מתיונין 213 עד לאוצין (M213L) בחלבון GJA1 והמוטציה TTC ל- TTG משבשת רצף PAM סמוך כדי להימנע ממהדורת גנים לא רצויה (איור 1). פרטי המוטציה מתוארים בדו"ח קודם4.
כדי לנתח גנוטיפים נכונים, מוצרי ה-PCR צריכים להתעכל על-ידי אנזים ההגבלה "NlaIII" לפני אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (איור 2, שלב 4). כפי שניתן לראות באיור 2A, מוצרי אלל PCR מסוג בר (WT) ייחתכו לשני מוצרים שונים של זוג בסיס (227 bp ו-441 bp). לעומת זאת, מוצרי PCR של אלל מוטנטיים יהיו שלמים (668 bp) בשל היעדר אתר זיהוי NlaIII על ידי מוטציה (איור 2B). אלקטרופורזה כללית agarose ניתן לבצע באמצעות מוצרי PCR מעוכלים (שלב 5). רצועות ספציפיות בג'ל האגרוז מציינות כל גנוטיפ (WT, סוג פראי; הט, הטרוזיגוס; הומוזיגוס). בשל ההגבלה שהוזכרה לעיל, כל גנוטיפ מביא למספר להקות בגדלים שונים (איור 2C). הלהקות יהיו שתי להקות WT (227 bp ו 441 bp), שלוש להקות ב Het (227 bp, 441 bp, ו 668 bp), ולהקה אחת ב Hm (668 bp), בהתאמה. על פי הדמיית הג'ל באמצעות אנזים הגבלה יחיד, ניתן להבחין בגנוטיפים נכונים של העכברים.
בניסוי שלנו, עשרים ואחד מייסדים יוצרו בתחילה, מתוכם תשעה היו הטרוזיגוס או חיות פסיפס. שניים מתוך תשעת המייסדים מתו לפני שגדלו לגיל הרבייה, ככל הנראה בשל פסיפסים בעלי תוכן גבוה של תאים סומטיים מוטנטיים דו-אלליים. שני קווי מוטציה עצמאיים הוקמו לאחר מכן משבעת המייסדים הנותרים על ידי קשירה לאחור לעכברי C57BL/6J פראיים במשך שני דורות לפחות. מכיוון שהמוטציה הממוקדת היא קטלנית כאשר הומוזיגוס, היינו צריכים לשמור על הקו כהטרוזיגוס לדילול נוסף של מוטציות אפשריות מחוץ למטרה. בעלי חיים ניסיוניים הומוזיגוס נוצרו על ידי הצלבת הדורות הבאים.
ראוי לציין כי רעילות עוברית גבוהה יחסית עם אוליגוס התורם ב 50 ng / μL היה מנוסה להזרקת אוליגוס התורם לתוך העוברים. עם זאת, ריכוז תורם של 12.5 ng/μL לא גרם רקומבינציה ממוקדת לגורים המתקבלים. בנוסף, נמצא כי משקעים אתנול נוסף של האוליגו סייעו בהסרת מזהמים ואפשרו אינדוקציה של עריכת גנום יעילה וממוקדת. שים לב כי שטיפת גלולה DNA עם 70% אתנול ממיס את הכדור לתוך פתרון. לכן, NaCl שימש בריכוז הסופי של 200 מ"מ כדי לזרז 10 מיקרוגרם של אוליגוס כדי למזער את נשיאת המלח לתוך מאגר מיקרו-אינפלציה pronuclear. הזרקת מבחן עם ניתוח בלסטוציסט נוסתה באמצעות 50 או 25 ng/ μL של אוליגוס התורם עם משקעים אתנול. שיעור ההצלחה של כל תנאי היה 76.9% (10 מתוך 13 דגימות עם 50 ננוגרם/μL) ו-25.0% (3 מתוך 12 דגימות עם 25 ננוגרם/μL) (איור 3A-C). למרות 50 ng/μL של אוליגו עם משקעים אתנול היה עדיין רעיל במקצת, ביצים רבות צריך להיות מוזרק, רקומביננטים יוצרו בשיעור הצלחה גבוה. לכן, 50 ng/μL של oligos התורם הוזרקו סוף סוף עם משקעים אתנול וקיבל בעלי חיים מייסדים עם 50.0% הצלחה (16 מתוך 32 גורים היה recombination כולל 21 ניצולים ו 11 מוות לאחר הלידה). שניים מבעלי החיים המייסדים בעלי העברת נבטים של מוטציה אחידה או מוטציה מונואלית או זהה עם שידור יציב שאושר על ידי רצף שימשו ליצירת קווים עצמאיים. הקונצנזוס הוא כי backcrossing שני דורות עם בעלי חיים מסוג בר ושימוש בחלבון Cas9 אמינות משופרת מבטל אירועים גדולים מחוץ למיקוד. מספר האירועים הללו אינו נבדל סטטיסטית משיעור הרקע של מוטציות דה נובו 19,20.
בעלי חיים עם גנוטיפים לא רצויים (סוג פראי או רקומביננטים לא נאותים) המשמשים לניסויים ובסיום המחקר הומתו על ידי שאיפת CO2 ואחריה נקע צוואר הרחם על פי פרוטוקול IACUC.
איור 1: ייצוג סכמטי למיקוד הגנים על ידי CRISPR/Cas9. (A) הרצפים הממוקדים לשילוב מחדש של ההומולוגים. חומצות אמינו באות אחת מוצגות בין הרצפים. גוונים צבעוניים מציינים זרוע הומולוגית (אפור), קודון מוטציה (ירוק), רצף PAM (כתום) ורצף יעד gRNA (כחול). החץ הכחול מציין GRNA. אתר ההגבלה NlaIII מסומן בקו תחתון על-ידי קו מנוקד. (ב) הרצפים השרטוטיים של WT ואלל מוטציה ואוליגו תורם עבור מוטציית הנקודה הביא מוטציה M213L. TCC ל- TCG היא מוטציה שקטה להפרעה של PAM לא רצויה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מוצרי PCR סכמטיים ואתר הגבלה של WT ואלל המוטציה. (A,B) ערכה של PCR והעיכול על ידי NlaIII. הפריימרים להגביר את 668 bp של DNA Gja1 סביב אתר המוטציה. מוצרי ה- PCR של אלל WT עוכלו לשני גדלים שונים על ידי NlaIII. לעומת זאת, האלל המוטנטי אינו מתעכל ומתחזק מוצרי PCR שלמים. (ג) התמונה הייצוגית של ג'ל האגרוז מצביעה על WT ואלל מוטציה. לכל גנוטיפ עכבר היה גודל רצועה מסוים; WT (נתיב 1, 3 ו-5), Het (נתיב 2) ו-Hm (נתיב 4). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יעילות הרקומבינציה בשתי מנות שונות של אוליגוס תורם בתערובת CRISPR. (A) תוצאות Genotyping של מורולה או בלסטוציסט שהוזרקו עם מינונים שונים (25 או 50 ננוגרם/ μL) של אוליגוס תורם המציג את סוג הבר (WT; נתיב #10, 12, ו -14), הטרוזיגוס / פסיפס (het / mosaic; נתיב # 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11, ו -13), הומוזיגוס (הום; נתיב #4 ו -5) או לא מוגבר (נתיב #7). שליטה חיובית מסוג Wild Type ו- H2O כשליטה שלילית נטענו בין נתיב #17 ו- #18. (B-D) תרשימי העוגה מייצגים את יעילות הרקומבינציה של תערובות CRISPR בשתי מנות שונות של אוליגוס תורם (B,C) וזה של בעלי חיים מייסדים מוזרק עם 50 ng/ μL של אוליגוס תורם (D). שים לב כי 11 מתוך 32 בעלי חיים שנולדו נהרגו על ידי האמהות או מתו לפני הגמילה. דגימות שלא הצליחו להגביר ב- PCR לא נכללו בחישוב יעילות רקומבינציה. קצב הגנוטיפ הבודד מכל הדגימות מצוין בטבלה 3 ובטבלה 4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שם | רצפים | הערות | |||
| crRNA | 5' AUUCAGAGCGAGAAGACACCAGU UUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 3' |
קו תחתון מציין רצף יעד CRSPR | |||
| אוליגו דונאר דנ"א | 5' CCCCACCAGGTGGACTGCTTCCTCTCACG TCCCACGGAGAAAACCATCTTCATCATCTTCT TACTGGTGGTGTCGTTGGTGTCTCTCTCTCTCT GAATCATTGAGCTCTTCTTCTATGTCTTCTTC 3' |
קו תחתון מציין קודונים שעברו מוטציה. אגרוף 60 bp לפני TTA mutaion ו 48 bp לאחר מוטיון TCG הם זרוע הומולוגיה | |||
| גנוטיפינג פריימר קדימה | 5' TGGGATTGAAGAACACGGCA 3' | ||||
| פריימר Genotyping הפוך | 5' CCACGATAGCTAAGGGCTGG 3' | ||||
טבלה 1: מידע אודות רצף.
| רכיב | פתרון מלאי | כמות | ריכוז סופי |
| תורם אוליגו | 1μg/μL ב- H2O ללא Rnase | 1.0 μL | 50 ננוגרם/μL |
| GJA1 crRNA | 1μg/μL ב- H2O ללא Rnase | 0.4 μL | 20 ננוגרם/μL |
| tracrRNA | 1μg/μL ב- H2O ללא Rnase | 0.8 μL | 40 ננוגרם/μL |
| חלבון eSpCas9 | 1μg/μL ב- H2O ללא Rnase | 1.0 μL | 50 ננוגרם/μL |
| מאגר הזרקה ללא RNAse | 0.1 מ"מ EDTA pH 8.0 | 16.8 μL | |
| 10 מ"מ טריס-HCl pH 7.5 | |||
| 100 מ"מ NaCl | |||
| אמצעי אחסון כולל | 20.0 μL |
טבלה 2: מתכון לתערובת CRISPR.
| ליין # (איור 3) | התורם אוליגו קונק. | מצב | לא מוגבר | סוג פראי | הט/פסיפס | הום | הערה |
| 1 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | הט/פסיפס | מחיקה | |||
| 2 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | הט/פסיפס | ||||
| 3 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | הט/פסיפס | ||||
| 4 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | הום | ||||
| 5 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | הום | ||||
| 6 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | הט/פסיפס | מחיקה | |||
| 7 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | N/A | ||||
| 8 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | הט/פסיפס | ||||
| 9 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | הט/פסיפס | ||||
| 10 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | סוג פראי | ||||
| 11 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | הט/פסיפס | ||||
| 12 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | סוג פראי | ||||
| 13 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | הט/פסיפס | נקודת הכניסה | |||
| 14 | 50 ננוגרם/מיקרול | מורולה | סוג פראי | ||||
| - | 3/13 (23.1%) | 8/13 (61.5%) | 2/13 (15.4%) | ||||
| 15 | 25 ננוגרם/מיקרול | מורולה | N/A | ||||
| 16 | 25 ננוגרם/מיקרול | מורולה | N/A | ||||
| 17 | 25 ננוגרם/מיקרול | מורולה | N/A | ||||
| 18 | 25 ננוגרם/מיקרול | מורולה | N/A | ||||
| 19 | 25 ננוגרם/מיקרול | מורולה | סוג פראי | ||||
| 20 | 25 ננוגרם/מיקרול | מורולה | N/A | ||||
| 21 | 25 ננוגרם/מיקרול | מורולה | סוג פראי | ||||
| 22 | 25 ננוגרם/מיקרול | מורולה | סוג פראי | ||||
| 23 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | N/A | ||||
| 24 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | סוג פראי | ||||
| 25 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | הט/פסיפס | ||||
| 26 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | סוג פראי | ||||
| 27 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | N/A | ||||
| 28 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | סוג פראי | ||||
| 29 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | סוג פראי | ||||
| 30 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | הט/פסיפס | הוספה/מחיקה | |||
| 31 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | סוג פראי | ||||
| 32 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | הט/פסיפס | נקודת הכניסה | |||
| 33 | 25 ננוגרם/מיקרול | בלסטוציסט | סוג פראי | ||||
| - | 9/12 (75.0%) | 3/12 (25.0%) | 0 (0.0%) |
טבלה 3: תוצאות גנוטיפינג ממורולה ובלסטוסיסט.
| בעל חיים # | התורם אוליגו קונק. | מצב | לא מוגבר | סוג פראי | הט/פסיפס | הום | הערה |
| d1 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | סוג פראי | ||||
| d2 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | הט/פסיפס | ||||
| d3 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | הט/פסיפס | מחיקה | |||
| d4 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | סוג פראי | ||||
| d5 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | הט/פסיפס | ||||
| d6 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | סוג פראי | ||||
| d7 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | הט/פסיפס | ||||
| d8 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | הט/פסיפס | ||||
| 34 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | הט/פסיפס | ||||
| 35 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 36 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 37 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | הט/פסיפס | משמש כקו עצמאי | |||
| 38 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 39 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 40 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 41 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | הט/פסיפס | ||||
| 42 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 43 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 44 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 45 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| d1 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | הום | ||||
| d2 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | סוג פראי | ||||
| d3 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור מת | הט/פסיפס | ||||
| 46 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | הט/פסיפס | ||||
| 47 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | הט/פסיפס | נקודת הכניסה | |||
| 48 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | הט/פסיפס | נקודת הכניסה | |||
| 49 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | הט/פסיפס | ||||
| 50 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 51 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | הט/פסיפס | משמש כקו עצמאי | |||
| 52 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 53 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | הט/פסיפס | הוספה/מחיקה | |||
| 54 | 50 ננוגרם/מיקרול | גור חי | סוג פראי | ||||
| 16/32 (50.0%) | 15/32 (46.9%) | 1/32 (3.1%) |
טבלה 4: תוצאות Genotyping מבעלי חיים מייסדים.
וידאו 1: הזרקת CRISPR לעוברים. תערובת CRISPR מוזרקת לעוברי שלב של תא אחד המתוארים בשלב 2.4. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
וידאו 2: Blastocysts להרים. הסרטון הייצוגי המציג בלסטוציסטים להרים בשלב 2.6. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מודל עכבר שעבר שינוי גנים הוא גישה נפוצה להבנת תפקוד הגנים. עם זאת, מאז GJA1-20k בתרגום פנימי איזופורם מתורגם מאותו Gja1 mRNA כמו Cx43 באורך מלא, אסטרטגיה יצירתית הומצאה כדי לשמור על ביטוי Cx43 באורך מלא עדיין לדכא ביטוי GJA1-20k. הגישה מבוססת על מוטציה של קודון ההתחלה הפנימי של GJA1-20k. עם מוטציה של נקודה אחת, M213 הוחלף ל- L ב- Gja1 mRNA, שהצליח לדכא את ביטוי GJA1-20k אך שמר על ביטוי Cx43באורך מלא 4.
עם זאת, המוטציה נקודתית של אתר התחלה של תרגום פנימי יחיד הציגה קושי נוסף: קביעת הגנוטיפים של העכבר. החלפת שאריות בודדת קטנה מכדי ליצור פריימרים ספציפיים. בנוסף, אללים WT ומוטציה מוטציה יש זוגות בסיס זהים. שלב נוסף נוסף לפרוטוקול genotyping כדי לפתור בעיות אלה. מאז קודון ההתחלה של GJA1-20k (אתר מוטציה ממוקדת) מוכר על ידי אנזים ההגבלה, NlaIII, האתר לא להיות מוכר על ידי NlaIII עבר מוטציה (איור 1; CATG ל- CTTA). בנוסף, הפריימרים ליצירת מוצר PCR תוכננו שאין לו אתר מתאים NlaIII אחר. פרוטוקול genotyping מתאים הוקם עבור קו העכבר שעבר מוטציה נקודתית על ידי הוספת שלב העיכול של האנזים עם אנזים ההגבלה. בדרך כלל, עיכול אנזימים נעשה על ידי דגירה לזמן קצר (0.5-2.0 שעות ב 37 °C (37 °F); דגירה לילית (~ 16 שעות) מומלץ לעכל לחלוטין את כל מוצר ה- PCR. כניסת המוטציה ברצף היעד גורמת לזיהוי המוטעה בין WT ואללים מוטנטיים. לכן, דגירה לילה לעיכול מספיק בפרוטוקול זה מומלץ אלא אם כן אנזים ההגבלה של בחירה יש את פעילות הכוכב21.
הפרויקט הנוכחי נועד לשבש את אתר ייזום התרגום השני על ידי שינוי ATG (מתיונין) ל- TTA (לאוצין). NlaIII הוא אנזים הגבלה נוח להקרנה מהירה כפי שהוא מזהה CATG באתר היעד. ציטוזין (C) משויך לעתים קרובות עם רצף KOZAK מיד לפני אתר ייזום התרגום. NcoI (C/ CATGG) ו- NdeI (CA / TATG) הם אנזימי הגבלה רב-תכליתיים אחרים להקרנה באזור זה אם יש צורך להשתמש בקודונים חלופיים ליצירה/מחיקה של אתרי הגבלה אלה. אם הכנסת מוטציות שקטות אינה מתירנית להקרנה מבוססת אתר ההגבלה, יש צורך בריצוף של דגימות בודדות22,23. בפרויקט זה, רקומבינציה ממוקדת הייתה יעילה למדי.
קו עכבר מוטציה M213L זה מאפשר לנו לנתח את הפונקציה של GJA1-20k. לאחרונה, באמצעות קו עכבר זה, זוהה כי GJA1-20k חיוני לסחר ויצירת צמתים פער Cx43 באורך מלא בלב4. מעניין, מוטציה הומוזיגוס M213L (Gja1M213L / M213L), כי זה לא יכול לייצר GJA1-20k, תמיד גורם למוות פתאומי 2-4 שבועות לאחר הלידה כי הלבבות המתאימים אינם יוצרים צמתים פערים בדיסק intercalated הלב. לעומת זאת, מוטציה הטרוזיגוס M213L מגלה קרוב לתפקוד לב נורמלי, ולעכברים יש תוחלת חיים דומה לזו של חיות WT4. מחקר הפריה חוץ גופית קודם הראה גם כי מוטציה M213L משבש היווצרות צומת פער תקין1. יתר על כן, שיבוש צומת פער זה ניצל על ידי טרנספקטוקציה אקסוגנית GJA1-20k. בהתבסס על היווצרות צומת פער נורמלי בלב עכבר מוטציה M213L הטרוזיגוס M213L במצב בסיסי4 ואת המחקר במבחנה 1, ניתן להסיק כי Cx43 באורך מלא עם מוטציה M213L שומר על תפקוד תקין כחלבון צומת פער.
בנוסף לתפקיד החיוני של GJA1-20k בסחר Cx43, GJA1-20k מעשיר את הממברנה החיצונית המיטוכונדריאלית, גרימת ביקוע מיטוכונדריאלי מגן וביוגנזה 3,24,25. במונחים של תפקוד מיטוכונדריאלי, עכברים עם מוטציה הטרוזיגוס של GJA1-20k (Gja1M213L / WT) יש רגישות קיצונית איסכמיה / פגיעה reperfusion. כאשר נחשף איסכמיה / reperfusion, עכברי Gja1M213L / WT בוגרים יש גודל אוטם הרבה יותר גדול ומיטוכונדריה משובשת יותר מאשר עמיתיהם WT25.
לסיכום, קו העכבר החדש המכיל את המוטציה M213L מועיל לניתוח של GJA1-20k בתרגום פנימי. יש לציין כי הן Cx43 באורך מלא והן GJA1-20k הקטן יותר באים לידי ביטוי בכל מערכות האיברים היונקים. מחקרים עתידיים צפויים לחקור את התפקיד של GJA1-20k לב נוסף גם כן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
הפרויקט נתמך על ידי מכונים לאומיים של מענקי בריאות (R01HL152691, R01HL138577, ו R01HL159983) ל RMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL 8-Strip PCR tube | Thomas Scientific | 1148A28 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Digestion buffer for NlaIII |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 50x TAE Buffer | Invitrogen | 24710-030 | |
| 96-well Thermal cycler | Applied Biosystems | Model # 9902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | mouse strain |
| Chemidoc MP imaging system | Bio-rad | To take gel image by 302 nm UV light | |
| eSpCas9 protein | MilliporeSigma | ESPCAS9PRO-50UG | |
| Gel Lading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | Loading buffer for electrophoresis |
| Gloves | |||
| hCG (human chorionic gonadotropin) | MilliporeSigma | 23-073-425G | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3884-100MG | |
| Image Lab software | Bio-rad | To analyze gel image | |
| Inverted stereo microscope whit plasDIC | Zeiss | Axiovert A1 | |
| KAPA Mouse Genotyping Kits | Roche Diagnostics | KK7352 | For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix |
| KSOM | LifeGlobal | ZEKS-050 | embryo culture medium |
| Lab coart | |||
| M2 medium | MilliporeSigma | MR015D | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | To digest PCR product |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9937 | To dilute reagents |
| Paraffin oil | Nacalai USA | 2613785 | |
| Plugged 20 μL fine pipette tip | FisherScientific | 02-707-171 | To pick up blastocytes |
| PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) | ProSpec-Tany | HOR-272 | |
| Sodium Chloride | Invitrogen | AM9760G | For pronuclear micorinjection buffer |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | To detect bands in gel |
| tracrRNA | Dharmacon | U-002000-120 | Guid RNA |
References
- Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
- Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs. Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).
- Fu, Y., et al. Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport. Frontiers in Physiology. 8, 905 (2017).
- Xiao, S., et al. Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias. Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).
- Syvanen, A. C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms. Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).
- Han, Y., et al. Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis. BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).
- Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).
- Peng, B. Y., et al. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Paquet, D., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
- Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos. Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).
- Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).
- Green, M. R. S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
- Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons. Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879 (2015).
- Iyer, V., et al. No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice. PLoS Genetics. 14 (7), 1007503 (2018).
- Nature Medicine.
- Mayer, H.
- Kozak, M. Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).
- Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell. 44 (2), 283-292 (1986).
- Basheer, W. A., et al. Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. JCI Insight. 3 (20), 121900 (2018).
- Shimura, D., et al. Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k. Elife. 10, 69207 (2021).
