Summary
Le protocole actuel décrit une seule mutation M213L dans Gja1 qui conserve la génération Connexin43 pleine longueur mais empêche la traduction de l’isoforme GJA1-20k traduite en interne plus petite.
Abstract
Le système d’édition de gènes CRISPR-Cas9, basé sur des mécanismes de réparation du génome, permet la génération de modèles murins modifiés par des gènes plus rapidement et plus facilement par rapport à la recombinaison homologue traditionnelle. Le système CRISPR-Cas9 est particulièrement attrayant lorsqu’une mutation monopoint est souhaitée. La protéine de jonction lacunaire, Connexin 43 (Cx43), est codée par le gène Gja1, qui a un seul exon codant et ne peut pas être épissé. Cependant, Gja1 produit non seulement la protéine Cx43 pleine longueur, mais jusqu’à six isoformes tronquées N-terminus par un processus connu sous le nom de traduction interne, résultat de l’initiation de la traduction ribosomique aux sites de départ internes AUG (méthionine). GJA1-20k est l’isoforme tronquée de Cx43 la plus couramment générée initiée au codon AUG à la position 213 de l’ARNm Gja1. Parce que le résidu 213 se produit à la fin du dernier domaine transmembranaire de Cx43, GJA1-20k est effectivement la queue C-terminus de 20 kDa de Cx43 en tant que protéine indépendante. Des chercheurs antérieurs ont identifié, dans les cellules, qu’un rôle essentiel de GJA1-20k est de faciliter le trafic des hémicanaux de jonction lacunaire Cx43 sur toute la longueur vers la membrane plasmique. Pour examiner ce phénomène in vivo, une souris mutante avec une mutation ponctuelle Gja1 a été générée qui remplace l’ATG (méthionine) au résidu 213 par la TTA (leucine, mutation M213L). Le résultat de M213L est que l’ARNm Gja1 et le Cx43 pleine longueur sont toujours générés, mais la traduction de Gja1-20k est considérablement réduite. Ce rapport se concentre sur le choix du site de l’enzyme de restriction pour développer un modèle murin à un acide aminé muté (Gja1 M213L / M213L). Ce protocole décrit des souris génétiquement modifiées par le système CRISPR-Cas9 et un génotypage rapide en combinant la PCR et les traitements enzymatiques de restriction.
Introduction
La Connexine 43 pleine longueur (Cx43) et l’isoforme tronquée N-terminus, GJA1-20k, codées par le même ARNm GJA1 mais utilisent des codons de départdifférents 1 pour initier la traduction. La traduction Cx43 se produit au premier codon de début AUG, tandis que la traduction GJA1-20k commence à l’AUG au résidu 213. Il a déjà été constaté que GJA1-20k a des rôles essentiels pour le trafic complet de Cx43, la stabilisation de l’actine et la régulation de la morphologie mitochondriale in vitro 1,2,3.
Pour comprendre le rôle de GJA1-20k in vivo, un modèle de souris GJA1-20k « knock-out » a été généré qui a conservé la capacité de créer un Cx43 pleine longueur. L’approche consistait à utiliser le système CRISPR-Cas9 pour remplacer le résidu unique à 213 d’une méthionine (M) à une leucine (L) (Gja1M213L/M213L)4. Une mutation interne de M à L diminue considérablement la probabilité de traduction interne tout en conservant la traduction et la fonction de la protéine4 pleine longueur. Étant donné que le type sauvage (WT) et l’allèle muté ont des tailles identiques et des produits d’ARNm presque identiques, il est très difficile de confirmer le génotype chez les souris. Le séquençage de l’ADN peut identifier la mutation, mais il est trop coûteux et prend trop de temps pour une utilisation de routine. En général, plusieurs méthodes de génotypage plus rapides ont été établies, telles que la réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR), la mini-ligature-ligature, l’analyse de fusion à haute résolution et le système de mutation réfractaire par amplification tétra-amorce PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Pourtant, ces méthodes alternatives nécessitent plusieurs étapes, des ressources uniques et / ou plusieurs ensembles d’amorces spécifiques qui peuvent induire des produits de PCR non spécifiques.
Ce protocole introduit une approche détaillée de ciblage et d’édition des gènes par CRISPR-Cas9 pour créer une mutation d’acide aminé unique, et un génotypage rapide est présenté pour confirmer la mutation. L’identification du génotype implique l’utilisation créative d’enzymes de restriction utilisant un seul ensemble d’amorces pour identifier le gène cible. Les lecteurs sont renvoyés à la référence4 pour observer l’effet électrophysiologique profond de la mort subite cardiaque causée par une mutation de substitutionGja1 M213L/M213L à un résidu qui génère toujours une protéine pleine longueur mais ne parvient pas à générer une isoforme de troncature traduite en interne plus petite. Ce protocole aidera d’autres modèles de souris à utiliser une mutation ponctuelle pour diminuer la traduction interne d’une isoforme d’intérêt tout en conservant l’expression de la protéine endogène pleine longueur.
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Protocol
« Tous les protocoles de soins et d’études sur les animaux ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux du Cedars-Sinai Medical Center et de l’Université de l’Utah. Des souris femelles C57BL/6J obtenues à partir de sources commerciales à l’âge de 8 à 9 semaines (voir tableau des matériaux) ont été utilisées pour les expériences.
1. Préparation au ciblage génique
- Sélectionnez la séquence cible guide autour du site de mutation ciblé codant M213 à l’aide de l’algorithme Web CRISPOR 4,9,10 (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Une séquence guide à 20 bases (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), dans le brin opposé de la séquence codante GJA1, avec un score MIT11 sur 62 a été sélectionnée dans laquelle le site de clivage potentiel est situé après 16 bases en aval du codon à muter (ATG) (Figure 1; la séquence complète de l’ARNc est illustrée dans le tableau 1). - Synthétisez l’ARNc et le tracrRNA qui interagissent avec Cas9 comme ARN guide12.
REMARQUE: Bien que le score MIT de l’ARN guide soit de 62, il n’y a qu’une seule mutation potentielle hors cible avec quatre incohérences à plus de 12 bases du PAM. Par conséquent, cet ARN guide est considéré comme sûr. - Concevoir un oligo donneur complémentaire à la séquence guide pour introduire une substitution d’acide aminé unique (ATG à TTA; M213L) avec 60 et 48 bases de bras d’homologie sur les côtés 5' et 3', respectivement.
REMARQUE: Cet oligo donneur comprend une mutation ponctuelle pour la perturbation du PAM (AGG à ACG) en introduisant une mutation silencieuse (TCC à TCG; S217S) pour éviter de rééditer après réparation dirigée par homologie CRISPR (HDR)13 pour l’introduction des mutations prévues (Figure 1 et Tableau 1). - Utiliser le NaCl (concentration finale de 200 mM) pour précipiter 10 μg d’oligos afin de minimiser le transfert de sel dans le tampon de micro-injection pronucléaire (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM d’EDTA et 100 mM de NaCl sans spermine ni spermidine14).
REMARQUE: Ne lavez pas la pastille d’ADN avec de l’éthanol à 70%, car la pastille peut être dissoute dans la solution. - Mélanger 50 ng/μL d’oligo donneur, 60 ng/μL de mélange aRNc/tracrRNA (rapport molaire 1:1) (à partir de l’étape 1.2) et 50 ng/μL de protéine eSpCas9 (voir Tableau des matériaux) pour obtenir le mélange CRISPR dans le volume final de 20 μL (tableau 2). Diminuer la concentration de l’oligo donneur si une toxicité élevée est observée (p. ex., 25 ng/μL).
2. Induction de la superovulation, récolte des œufs, microinjection pronucléaire du mélange CRISPR et dépistage des blastocystes
REMARQUE : Cette procédure suit un protocole général14 publié précédemment.
- Injecter 5 UI de PMSG (gonadotrophine sérique de jument gravide) (voir tableau des matériaux) dans 100 μL d’eau stérile à 5-10 souris à l’âge de 8 semaines par une approche intrapéritonéale vers 3h00 p.m. (jour 1).
- Injecter 5 UI d’hCG (gonadotrophine chorionique humaine) (voir tableau des matériaux) dans 100 μL d’eau stérile aux donneuses d’ovules par une approche intrapéritonéale 46-48 h après l’injection de PMSG (jour 3). Mettre en place un élevage 1:1 avec des mâles étalons.
- Récolter les œufs fécondés dans un milieu M2 avec de la hyaluronidase, laver trois fois dans 100 μL de milieu M2 vers 10h00 a.m., puis conserver dans le milieu mWM15 ou KSOM16 (jour 4) (voir tableau des matériaux).
- Introduire le mélange CRISPR (étape 1.3) dans des embryons au stade 1 cellule prélevés sur les souris par microinjection pronucléaire14 dans 100 μL de M2 recouverts d’huile de paraffine dans un plat en plastique sur un microscope inversé avec une optique améliorant le contraste en début ou en fin d’après-midi (vidéo 1).
NOTE: La microinjection pronucléaire du mélange CRISPR a été réalisée sur des embryons au stade 1 cellule à 14-16 h après le coït (p.c.). Les embryons injectés ont été cultivés dans un incubateur à 5% de CO2 pendant quelques heures et transférés chirurgicalement à 18-20 h p.c. chez des souris ICR receveuses qui avaient un bouchon de copulation le matin même. - Transférer 20 à 30 embryons à 2 cellules dans chaque receveur pour produire des animaux recombinants.
REMARQUE: Suivez le protocole général14 ou cultivez ces embryons dans un milieu mWM ou KSOM pendant 4 jours pour valider l’efficacité et examiner la toxicité. La toxicité du mélange CRISPR est acceptable lorsqu’au moins un tiers des embryons injectés atteignent tôt le stade de blastocyste complètement expansé avec plusieurs recombinants parmi eux. Dans le même temps, plus de 90% des embryons non manipulés atteignent le même stade de blastocyste dans une culture parallèle. Suivez l’étape 2.6-2.9 pour le dépistage du blastcyste qui n’est pas essentiel mais peut être fait si vous préférez quantifier le taux de réussite du HDR. - Prélever individuellement les blastocystes précoces à complètement expansés avec 2 μL de milieu de culture à l’aide d’une pointe de pipette fine bouchée bouchée avec un micropipetter dans des tubes PCR simples (jour 8; Vidéo 2).
- Lyser les blastocystes dans 8 μL de mélange de digestion (identique à l’étape 3.2; voir tableau des matériaux) et traiter à 75 °C pendant 10 min, 95 °C pendant 5 min, puis refroidir à 4 °C pour le stockage. Utilisez 2 μL de lysat comme modèle pour la PCR dans un mélange PCR total de 15 μL (étape 3).
- Examiner l’efficacité du HDR par électrophorèse sur gel d’agarose17 des échantillons PCR après digestion de restriction avec NlaIII (étape 3-5).
- Confirmer l’état de la recombinaison ciblée en séquençant l’amplicon17 de 668 pb chez les fondateurs et la descendance subséquente pour confirmer l’intégrité de la mutation.
3. Extraction de l’ADN
REMARQUE: Des souris au jour postnatal 10 ont été utilisées pour cette expérience en raison de la mort subite de la souris knock-out GJA1-20k environ 2 à 4 semaines après la naissance4. Un protocole plus général peut également être appliqué à la suite du rapport18 publié précédemment.
- Coupez 1 à 3 mm de l’extrémité de l’orteil ou de la queue avec des ciseaux propres et transférez-le dans un tube PCR à 8 bandes de 0,2 mL. Pour éviter la contamination parmi les échantillons d’orteils ou de queue, utilisez des ciseaux pré-nettoyés ou une lame par souris ou nettoyez avant chaque échantillon en utilisant 70% d’éthanol ou 10% d’eau de Javel. Si la queue saigne après l’échantillonnage, appliquez une brève pression avec de la gaze pour arrêter le saignement. Conservez les échantillons de queue à -20 °C jusqu’à l’extraction jusqu’à environ une semaine.
- Ajouter la solution de lyse tissulaire (voir tableau des matériaux) dans un tube de 100 μL et bien mélanger, puis faire tourner avec une mini-centrifugeuse de table (2 200 x g pendant 10 s à température ambiante). Assurez-vous que les échantillons de queue sont immergés dans la solution.
- Réglez les tubes sur un cycleur thermique réglé par le programme suivant; 75 °C pendant 10 min (lyse tissulaire), 95 °C pendant 5 min (inactivation) et 4 °C (maintien). Conservez le lysat tissulaire à 4 °C jusqu’à une semaine si les PCR ne peuvent pas être effectuées immédiatement.
4. Amplification de l’ADN par PCR
- Préparer une solution PCR contenant 5 μL deH2O sans nucléase, 0,75 μL d’amorces avant et arrière de 10 μM et 7,5 μL de mélange maître PCR (voir tableau des matériaux) par échantillon dans un nouveau tube PCR (voir tableau des séquences d’amorce). S’il y a plusieurs échantillons, mettez à l’échelle le contenu jusqu’à aliquote 14 μL par tube.
- Ajouter 1 μL de lysat tissulaire à la solution PCR préparée à l’étape 3.1. Veillez à ne pas toucher la queue.
- Bien mélanger et tourner avec une mini-centrifugeuse de table (2 200 x g pendant 10 s à température ambiante).
- Réglez les tubes sur un cycleur thermique réglé par le programme mentionné ci-dessous. Conservez les produits PCR à 4 °C pendant 1 à 2 mois ou environ 1 an à -20 °C.
REMARQUE : 95 °C pendant 3 min (étape 1, Dénaturation initiale), 95 °C pendant 15 s (étape 2, Dénaturation), 60 °C pendant 15 s (étape 2, Recuit), 72 °C pendant 45 s (étape 2, Extension), répéter l’étape 2 pendant 35 cycles, 72 °C pendant 10 min (étape 3, Extension finale) et 4 °C (étape 4, Maintien).
5. Incubation avec enzyme de restriction
- Préparer la solution enzymatique contenant 7 μL deH2Osans nucléase, 2 μL de tampon CutSmart 10x et 1 μL d’enzyme de restriction NlaIII (voir tableau des matériaux). S’il y a plusieurs échantillons, multipliez chaque contenu pour obtenir le mélange et aliquote 10 μL par tube.
- Ajouter 10 μL de produit PCR obtenu à l’étape 3 à la solution enzymatique par tube.
- Bien mélanger et tourner avec une mini-centrifugeuse de table (2 200 x g pendant 10 s à température ambiante).
- Réglez les tubes sur un cycleur thermique ou un bloc thermique réglé par le programme mentionné ci-dessous. Conserver le produit après l’incubation à 4 °C pendant 1-2 mois ou ~1 an à -20 °C.
NOTE: 37 °C pendant 16 h (au moins 2 h; un temps d’incubation court peut entraîner un clivage insuffisant) et 4 °C pour la détention.
6. Détection de la bande d’ADN
- Préparez un gel d’agarose à 1,5% contenant une tache de gel d’ADN pour l’électrophorèse.
- Ajouter 0,75 g d’agarose dans 50 mL de tampon TAE 1x, puis mélanger et chauffer au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement. Après refroidissement, ajouter 5 μL de tache d’ADN et mélanger doucement.
- Verser dans le moule en gel (25 mL par moule) et laisser le gel se solidifier. Pour obtenir une meilleure résolution et séparation, augmentez la concentration d’agarose à 2,5% -4% au besoin.
- Chargez 10 μL de produit PCR digéré dans le puits. Mélangez 6x tampon de chargement, si nécessaire.
- Faites fonctionner le gel avec 100 V pendant 35 min.
REMARQUE : Ces paramètres peuvent nécessiter une optimisation. - Image sous lumière UV (longueur d’onde de 302 nm).
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Representative Results
Le système d’édition de gènes CRISPR/Cas9 produit une mutation ATG en TTA et une mutation silencieuse TCC en TCG à 56 264 279 à 56 264 281 et à 56 264 291 à 56 264 293 sur le chromosome 10 de la souris, ou à 869 à 871 et 881 à 883 sur l’ARNm Gja1, respectivement. Ces mutations entraînent une mutation de la méthionine 213 à la leucine (M213L) sur la protéine GJA1 et la mutation TTC en TTG perturbe une séquence PAM voisine pour éviter une édition génétique indésirable (Figure 1). Les détails de la mutation sont décrits dans un rapport précédent4.
Pour analyser les génotypes appropriés, les produits de PCR doivent être digérés par l’enzyme de restriction « NlaIII » avant l’électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 2, étape 4). Comme le montre la figure 2A, les produits de PCR allèle de type sauvage (WT) seront coupés en deux produits de paire de base différents (227 pb et 441 pb). En revanche, les produits de PCR des allèles mutants seront intacts (668 pb) en raison de l’absence de site de reconnaissance NlaIII par mutation (Figure 2B). L’électrophorèse générale de l’agarose peut être réalisée à l’aide des produits de PCR digérés (étape 5). Des bandes spécifiques dans le gel d’agarose indiquent chaque génotype (WT, type sauvage; Het, hétérozygote; Hm, homozygote). En raison de la restriction mentionnée ci-dessus, chaque génotype entraîne plusieurs bandes de tailles différentes (Figure 2C). Les bandes seront deux bandes en WT (227 pb et 441 pb), trois bandes en Het (227 pb, 441 pb et 668 pb) et une bande en Hm (668 pb), respectivement. Selon l’imagerie sur gel utilisant une seule enzyme de restriction, les génotypes appropriés des souris peuvent être distingués.
Dans notre expérience, vingt-et-un fondateurs ont été initialement produits, dont neuf étaient des animaux hétérozygotes ou mosaïques. Deux des neuf fondateurs sont morts avant d’avoir atteint l’âge de la reproduction, probablement en raison du mosaïcisme à haute teneur des cellules somatiques mutantes bi-alléliques. Deux lignées mutantes indépendantes ont ensuite été établies à partir des sept fondateurs restants en se croisant avec des souris C57BL/6J de type sauvage pendant au moins deux générations. Parce que la mutation ciblée est létale lorsqu’elle est homozygote, nous avons dû maintenir la lignée comme hétérozygote pour diluer davantage d’éventuelles mutations hors cible. Les animaux de laboratoire homozygotes ont été produits en croisant les générations suivantes.
Il convient de noter qu’une toxicité embryonnaire relativement élevée avec les oligos du donneur à 50 ng / μL a été expérimentée pour l’injection des oligos du donneur dans les embryons. Cependant, une concentration de donneurs de 12,5 ng / μL n’a pas induit la recombinaison ciblée chez les chiots résultants. De plus, il a été constaté que l’ajout de précipitation d’éthanol des oligos aidait à éliminer les contaminants et permettait l’induction d’une édition efficace et ciblée du génome. Notez que le lavage de la pastille d’ADN avec de l’éthanol à 70% dissout la pastille dans une solution. Par conséquent, le NaCl a été utilisé à une concentration finale de 200 mM pour précipiter 10 μg d’oligos afin de minimiser le transfert de sel dans le tampon de micro-injection pronucléaire. L’injection expérimentale avec analyse de blastocyste a été tentée en utilisant 50 ou 25 ng / μL des oligos donneurs avec précipitation d’éthanol. Le taux de réussite de chaque condition était de 76,9 % (10 des 13 échantillons avec 50 ng/μL) et de 25,0 % (3 des 12 échantillons avec 25 ng/μL) (Figure 3A-C). Bien que 50 ng/μL d’oligo avec précipitation d’éthanol soient encore quelque peu toxiques, de nombreux œufs ont dû être injectés et les recombinants ont été produits à un taux de réussite élevé. Par conséquent, 50 ng/μL des oligos donneurs ont finalement été injectés avec une précipitation d’éthanol et ont obtenu des animaux fondateurs avec un taux de réussite de 50,0% (16 des 32 chiots ont eu une recombinaison, dont 21 survivants et 11 décès après la naissance). Deux des animaux fondateurs ayant une transmission germinale de mutation uniforme ou monoallélique ou identique avec une transmission stable confirmée par séquençage ont été utilisés pour établir des lignées indépendantes. Le consensus est que le rétrocroisement de deux générations avec des animaux de type sauvage et l’utilisation de la protéine Cas9 à fidélité améliorée éliminent les événements majeurs de non-ciblage. Le nombre de tels événements n’est pas statistiquement distinguable du taux de fond des mutations de novo 19,20.
Les animaux avec des génotypes indésirables (type sauvage ou recombinants inappropriés) utilisés pour des expériences et à la fin de l’étude ont été euthanasiés par inhalation de CO2 suivie d’une luxation cervicale selon le protocole de l’IACUC.
Figure 1 : Représentation schématique du ciblage génique par CRISPR/Cas9. (A) Les séquences ciblées pour la recombinaison des homologues. Les acides aminés d’une seule lettre sont représentés entre les séquences. Les reflets colorés indiquent le bras d’homologie (gris), le codon de mutation (vert), la séquence PAM (orange) et la séquence cible de l’ARNg (bleu). La flèche bleue indique l’ARNg. Le site de restriction NlaIII est souligné par une ligne pointillée. (B) Les séquences schématiques de WT et d’allèle mutant et d’oligo donneur pour la mutation ponctuelle ont abouti à la mutation M213L. TCC à TCG est une mutation silencieuse pour la perturbation de PAM indésirable. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Produits de PCR schématiques et site de restriction de WT et de l’allèle mutant. (A,B) Schéma de la PCR et de la digestion par NlaIII. Les amorces amplifient les 668 pb d’ADN Gja1 autour du site de mutation. Les produits de PCR de l’allèle WT ont été digérés en deux tailles différentes par NlaIII. En revanche, l’allèle mutant n’est PAS digéré et maintient des produits pcR intacts. (C) L’image représentative du gel d’agarose indique WT et allèle mutant. Chaque génotype de souris avait une taille de bande spécifique; WT (voies 1, 3 et 5), Het (voie 2) et Hm (voie 4). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Efficacité de la recombinaison en deux doses différentes d’oligos donneurs dans le mélange CRISPR. (A) Résultats du génotypage des morulaes ou des blastocystes injectés avec différentes doses (25 ou 50 ng/μL) d’oligos donneurs montrant le type sauvage (WT; voie #10, 12 et 14), hétérozygote/mosaïque (het/mosaïque ; voie # 1, 2, 3, 6, 8, 9, 11 et 13), homozygotes (hom; voie #4 et 5) ou non amplifiée (voie #7). Le témoin positif de type sauvage et le contrôle négatif H2O ont été chargés entre les voies no 17 et no 18. (B-D) Les diagrammes circulaires représentent l’efficacité de recombinaison des mélanges CRISPR en deux doses différentes d’oligos donneurs (B,C) et celle des animaux fondateurs injectés avec 50 ng/μL d’oligos donneurs (D). Notez que 11 des 32 animaux nés ont été tués par les mères ou sont morts avant le sevrage. Les échantillons qui n’ont pas réussi à s’amplifier dans la PCR ont été exclus dans le calcul de l’efficacité de recombinaison. Le taux de génotype individuel de tous les échantillons est indiqué dans les tableaux 3 et 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Nom | Séquences | Commentaires | |||
| ARNc | 5' AUUCAGAGCGAGAGACACCAGU UUUAGAGCUAUGCUGUUUUG 3' |
Le soulignement indique la séquence cible CRSPR | |||
| ADN oligo-donaire | 5' CCCCACCAGGTGGACTGCTTCCTCTCACG TCCCACGGAGAAAACCATCTTCATCATCTTCT TACTGGTGGTGTCGTTGGTGTCTCTCGCTCTCTCT GAATATCATTGAGCTCTTCTATGTCTTCTTC 3' |
Le soulignement indique des codons mutés. Fist 60 bp avant le mutaion TTA et 48 bp après le mutaion TCG sont le bras d’homologie | |||
| Amorce de génotypage vers l’avant | 5' TGGGATTGAAGAACACGGCA 3' | ||||
| Amorce de génotypage Inverse | 5' CCACGATAGCTAAGGGCTGG 3' | ||||
Tableau 1 : Informations sur la séquence.
| Composant | Solution de stock | Quantité | Concentration finale |
| Oligo donneur | 1μg/μL dans H2 O sansArnse | 1,0 μL | 50 ng/μL |
| ARNcR GJA1 | 1μg/μL dans H2 O sansArnse | 0,4 μL | 20 ng/μL |
| tracrRNA | 1μg/μL dans H2 O sansArnse | 0,8 μL | 40 ng/μL |
| Protéine eSpCas9 | 1μg/μL dans H2 O sansArnse | 1,0 μL | 50 ng/μL |
| Tampon d’injection sans ARN | 0,1 mM EDTA pH 8,0 | 16,8 μL | |
| 10 mM Tris-HCl pH 7,5 | |||
| 100 mM de NaCl | |||
| Volume total | 20,0 μL |
Tableau 2 : Recette du mélange CRISPR.
| Numéro de voie (Figure 3) | Oligo conc. donneur. | Statut | Non amplifié | Type sauvage | Het/mosaïque | Hom | Note |
| 1 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaïque | Délétion | |||
| 2 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaïque | ||||
| 3 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaïque | ||||
| 4 | 50 ng/μl | Morula | Hom | ||||
| 5 | 50 ng/μl | Morula | Hom | ||||
| 6 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaïque | Délétion | |||
| 7 | 50 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 8 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaïque | ||||
| 9 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaïque | ||||
| 10 | 50 ng/μl | Morula | Type sauvage | ||||
| 11 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaïque | ||||
| 12 | 50 ng/μl | Morula | Type sauvage | ||||
| 13 | 50 ng/μl | Morula | Het/mosaïque | Insertion | |||
| 14 | 50 ng/μl | Morula | Type sauvage | ||||
| - | 3/13 (23.1%) | 8/13 (61.5%) | 2/13 (15.4%) | ||||
| 15 | 25 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 16 | 25 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 17 | 25 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 18 | 25 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 19 | 25 ng/μl | Morula | Type sauvage | ||||
| 20 | 25 ng/μl | Morula | N/A | ||||
| 21 | 25 ng/μl | Morula | Type sauvage | ||||
| 22 | 25 ng/μl | Morula | Type sauvage | ||||
| 23 | 25 ng/μl | Blastocyste | N/A | ||||
| 24 | 25 ng/μl | Blastocyste | Type sauvage | ||||
| 25 | 25 ng/μl | Blastocyste | Het/mosaïque | ||||
| 26 | 25 ng/μl | Blastocyste | Type sauvage | ||||
| 27 | 25 ng/μl | Blastocyste | N/A | ||||
| 28 | 25 ng/μl | Blastocyste | Type sauvage | ||||
| 29 | 25 ng/μl | Blastocyste | Type sauvage | ||||
| 30 | 25 ng/μl | Blastocyste | Het/mosaïque | Insertion/suppression | |||
| 31 | 25 ng/μl | Blastocyste | Type sauvage | ||||
| 32 | 25 ng/μl | Blastocyste | Het/mosaïque | Insertion | |||
| 33 | 25 ng/μl | Blastocyste | Type sauvage | ||||
| - | 9/12 (75.0%) | 3/12 (25.0%) | 0 (0.0%) |
Tableau 3 : Résultats du génotypage de Morula et de Blastocyste.
| Animal # | Oligo conc. donneur. | Statut | Non amplifié | Type sauvage | Het/mosaïque | Hom | Note |
| d1 | 50 ng/μl | Chiot mort | Type sauvage | ||||
| d2 | 50 ng/μl | Chiot mort | Het/mosaïque | ||||
| d3 | 50 ng/μl | Chiot mort | Het/mosaïque | Délétion | |||
| d4 | 50 ng/μl | Chiot mort | Type sauvage | ||||
| d5 | 50 ng/μl | Chiot mort | Het/mosaïque | ||||
| d6 | 50 ng/μl | Chiot mort | Type sauvage | ||||
| d7 | 50 ng/μl | Chiot mort | Het/mosaïque | ||||
| d8 | 50 ng/μl | Chiot mort | Het/mosaïque | ||||
| 34 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Het/mosaïque | ||||
| 35 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 36 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 37 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Het/mosaïque | utilisé comme ligne indépendante | |||
| 38 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 39 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 40 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 41 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Het/mosaïque | ||||
| 42 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 43 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 44 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 45 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| d1 | 50 ng/μl | Chiot mort | Hom | ||||
| d2 | 50 ng/μl | Chiot mort | Type sauvage | ||||
| d3 | 50 ng/μl | Chiot mort | Het/mosaïque | ||||
| 46 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Het/mosaïque | ||||
| 47 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Het/mosaïque | Insertion | |||
| 48 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Het/mosaïque | Insertion | |||
| 49 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Het/mosaïque | ||||
| 50 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 51 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Het/mosaïque | utilisé comme ligne indépendante | |||
| 52 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 53 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Het/mosaïque | Insertion/suppression | |||
| 54 | 50 ng/μl | Chiot vivant | Type sauvage | ||||
| 16/32 (50.0%) | 15/32 (46.9%) | 1/32 (3.1%) |
Tableau 4 : Résultats du génotypage des animaux fondateurs.
Vidéo 1 : Injection de CRISPR aux embryons. Le mélange CRISPR est injecté dans des embryons au stade 1 cellule décrits à l’étape 2.4. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2 : Les blastocystes reprennent. La vidéo représentative montrant les blastocystes reprend à l’étape 2.6. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Un modèle murin modifié par un gène est une approche courante pour comprendre la fonction des gènes. Cependant, étant donné que l’isoforme GJA1-20k traduite en interne est traduite à partir du même ARNm Gja1 que Cx43 pleine longueur, une stratégie créative a été conçue pour conserver l’expression Cx43 pleine longueur tout en supprimant l’expression GJA1-20k. L’approche est basée sur une mutation du codon de départ interne de GJA1-20k. Avec une mutation ponctuelle unique, M213 a été basculé en L sur l’ARNm Gja1 , qui a réussi à supprimer l’expression de GJA1-20k mais a conservé l’expression Cx43pleine longueur 4.
Cependant, la mutation ponctuelle d’un seul site de début de traduction interne présentait une autre difficulté : déterminer les génotypes des souris. Une seule substitution de résidu est trop petite pour fabriquer des amorces spécifiques. De plus, les allèles WT et mutation ont des paires de bases identiques. Une étape supplémentaire a été ajoutée au protocole de génotypage pour résoudre ces problèmes. Étant donné que le codon de départ de GJA1-20k (site de mutation ciblé) est reconnu par l’enzyme de restriction, NlaIII, le site à ne pas reconnaître par NlaIII a été muté (Figure 1; CATG à CTTA). De plus, les amorces pour générer un produit de PCR ont été conçues qui n’ont pas d’autre site approprié NlaIII. Un protocole de génotypage approprié a été établi pour la lignée de souris mutée ponctuellement en ajoutant l’étape de digestion enzymatique avec l’enzyme de restriction. Généralement, la digestion enzymatique se fait par incubation de courte durée (0,5-2,0 h à 37 °C); L’incubation pendant la nuit (~16 h) est recommandée pour digérer complètement l’ensemble du produit PCR. L’introduction d’une mutation dans la séquence cible entraîne une mauvaise reconnaissance entre WT et les allèles mutants. Par conséquent, une incubation nocturne pour une digestion suffisante dans ce protocole est recommandée à moins que l’enzyme de restriction de choix n’ait l’activité stellaire21.
Le projet actuel visait à perturber le deuxième site d’initiation de la traduction en remplaçant l’ATG (méthionine) par la TTA (Leucine). Le NlaIII est une enzyme de restriction pratique pour un dépistage rapide car il reconnaît catG dans le site de ciblage. La cytosine (C) est souvent associée à la séquence KOZAK immédiatement avant le site d’initiation de la traduction. Le NcoI (C/CATGG) et le NdeI (CA/TATG) sont d’autres enzymes de restriction polyvalentes pour le dépistage dans cette région si d’autres codons doivent être utilisés pour la création/suppression de ces sites de restriction. Si l’introduction de mutations silencieuses n’est pas permissive pour le dépistage basé sur le site de restriction, le séquençage d’échantillons individuels est nécessaire22,23. Dans ce projet, la recombinaison ciblée a été assez efficace.
Cette ligne de souris mutante M213L nous permet d’analyser la fonction de GJA1-20k. Récemment, en utilisant cette ligne de souris, il a été identifié que GJA1-20k est essentiel au trafic et à la formation de jonctions lacunaires Cx43 pleine longueur dans le cœur4. Fait intéressant, la mutation homozygote M213L (Gja1M213L / M213L), car elle ne peut pas générer GJA1-20k, entraîne toujours une mort subite 2 à 4 semaines après la naissance car les cœurs respectifs ne forment pas de jonctions lacunaires au niveau du disque intercalé cardiaque. En revanche, une mutation hétérozygote M213L révèle une fonction cardiaque proche de la normale, et les souris ont une durée de vie similaire à celle des animaux WT4. Une étude in vitro antérieure a également montré que la mutation M213L perturbe la formation correcte de la jonction lacunaire1. De plus, cette perturbation de la jonction d’écart est sauvée par une transfection exogène GJA1-20k. Sur la base de la formation normale de jonctions lacunaires dans le cœur hétérozygote de souris mutant M213L dans les conditions basales4 et de l’étude in vitro 1, on peut conclure que le Cx43 pleine longueur avec mutation M213L maintient le bon fonctionnement en tant que protéine de jonction lacunaire.
En plus du rôle essentiel de GJA1-20k dans le trafic de Cx43, GJA1-20k enrichit la membrane externe mitochondriale, induisant une fission mitochondriale protectrice et une biogenèse 3,24,25. En termes de fonction mitochondriale, les souris porteuses d’une mutation hétérozygote de GJA1-20k (Gja1M213L/WT) ont une sensibilité extrême aux lésions d’ischémie/reperfusion. Lorsqu’elles sont exposées à une ischémie/reperfusion, les souris adultesGja1 M213L/WT ont une taille d’infarctus beaucoup plus grande et des mitochondries plus perturbées que leurs homologues WT25.
En résumé, la nouvelle ligne de souris contenant la mutation M213L est utile pour l’analyse de GJA1-20k traduit en interne. Il convient de noter que Cx43 pleine longueur et GJA1-20k plus petit sont exprimés dans tous les systèmes d’organes de mammifères. De futures études devraient également explorer le rôle de l’extracardiaque GJA1-20k.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Le projet a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 et R01HL159983) à RMS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL 8-Strip PCR tube | Thomas Scientific | 1148A28 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 10x CutSmart buffer | New England Biolabs | B7204S | Digestion buffer for NlaIII |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Invitrogen | 15567-027 | For pronuclear micorinjection buffer |
| 50x TAE Buffer | Invitrogen | 24710-030 | |
| 96-well Thermal cycler | Applied Biosystems | Model # 9902 | |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | mouse strain |
| Chemidoc MP imaging system | Bio-rad | To take gel image by 302 nm UV light | |
| eSpCas9 protein | MilliporeSigma | ESPCAS9PRO-50UG | |
| Gel Lading Dye Purple (6x) | New England Biolabs | B7024S | Loading buffer for electrophoresis |
| Gloves | |||
| hCG (human chorionic gonadotropin) | MilliporeSigma | 23-073-425G | |
| Hyaluronidase | MilliporeSigma | H3884-100MG | |
| Image Lab software | Bio-rad | To analyze gel image | |
| Inverted stereo microscope whit plasDIC | Zeiss | Axiovert A1 | |
| KAPA Mouse Genotyping Kits | Roche Diagnostics | KK7352 | For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix |
| KSOM | LifeGlobal | ZEKS-050 | embryo culture medium |
| Lab coart | |||
| M2 medium | MilliporeSigma | MR015D | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | To digest PCR product |
| Nuclease-Free Water | Ambion | AM9937 | To dilute reagents |
| Paraffin oil | Nacalai USA | 2613785 | |
| Plugged 20 μL fine pipette tip | FisherScientific | 02-707-171 | To pick up blastocytes |
| PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) | ProSpec-Tany | HOR-272 | |
| Sodium Chloride | Invitrogen | AM9760G | For pronuclear micorinjection buffer |
| SYBR safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | To detect bands in gel |
| tracrRNA | Dharmacon | U-002000-120 | Guid RNA |
References
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